Донг фенг н30: Купить DongFeng H30 Cross с пробегом: продажа автомобилей ДонгФенг Н30 Кросс б/у в Москве

Купите Донг Фенг Н30 Кросс цены и комплектации 2019-2020 на новый Dongfeng h40 Cross у официального дилера, автосалон, Москва

	Comfort	Luxury
Внешнее оборудование
Фары головного света с LED дневными ходовыми огнями	☑	☑
Электрокорректор передних фар	☑	☑
Комплект внешней пластиковой отделки кузова/защитный пластиковый обвес по периметру кузова	☑	☑
Багажные дуги (рейлинги) на крыше	☑	☑
Боковые зеркала заднего вида с электроприводом и повторителями указателей поворота	☑	☑
Задние фонари с LED габаритными огнями	☑	☑
Хромированные молдинги кузова	☑	☑
Подогрев боковых зеркал заднего вида		☑
Задние противотуманные фары	☑	☑
Базовая тонировка стёкол	☑	☑
Задний спойлер	☑	☑
Наружные зеркала и ручки дверей в цвет кузова	☑	☑
Легкосплавные колёсные диски R16	☑	☑
Люк с электроприводом		☑
Внутреннее оборудование
Декоративные вставки салона под карбон	☑	☑
Материал отделки салона — ткань	☑	☑
Ручная регулировка сиденья водителя в 6-ти направлениях	☑	☑
Складывающиеся задние сиденья в пропорции 60/40	☑	☑
Салонное зеркало заднего вида с антибликовым покрытием	☑	☑
Рулевое колесо с отделкой кожей и декоративной вставкой под дерево, цвет — «Royal Black»	☑	☑
Отсек для солнцезащитных очков		☑
Дополнительная емкость под полом багажника	☑	☑
Передний центральный подлокотник с бардачком	☑	☑
Передний центральный подстаканник	☑	☑
Солнцезащитные козырьки с зеркалами	☑	☑
Аудио/Видео и Навигационная система
MР3 USB порт с функцией зарядки устройств	☑	☑
Мультифункциональный руль с кнопками управления аудиосистемой	☑
Мультифункциональный руль с кнопками управления аудио- и ASCD-системой (круиз-контроль)		☑
Мультимедийный центр с цветным touch-screen дисплеем 6,5″	☑	☑
Опция «Bluetooth+hands-free telephone»		☑
Количество динамиков	4	6
Основное оборудование
Бортовой компьютер	☑	☑
Бортовой компьютер с камерой заднего вида		☑
Центральный замок с дистанционным управлением	☑	☑
Пульт дистанционного управления со складным ключом и функцией поиска автомобиля	☑	☑
Система круиз-контроля ASCD		☑
Регулировка руля по вылету и высоте наклона	☑	☑
Стеклоподъёмники четырёх стёкол с электроприводом	☑	☑
Кондиционер	☑
Климат-контроль		☑
Регулировка яркости панели приборов	☑	☑
Передние/Задние лампы освещения салона	☑	☑
Кнопки управления стеклоподъёмниками с подсветкой	☑	☑
Функция автоматического освещения багажника	☑	☑
Функция задержки выключения головного света	☑	☑
Полноразмерное запасное колесо	☑	☑

Официальный дилер Dongfeng (Донг Фенг) в Санкт-Петербурге

Dongfeng

Компания Dongfeng имеет огромную популярность во всем мире, и теперь ее легковые автомобили мы можем найти и на российском рынке.

Автомобили Dongfeng отличают своим собственным стилем, экономичностью и комфортабельностью. Покупая автомобиль от китайской марки Dongfeng, Вы получаете надежного, безопасного и привлекательного друга, который будет верен Вам в любой сложившейся ситуации. Вы можете быть уверенными, что автомобиль прослужит Вам долгое время.

Компания Eastcom является официальным представителем (дилером) Dongfeng (ДунФэн) в Санкт-Петербурге. В наших салонах Вы можете приобрести автомобиль любого цвета и комплектации, будь то модель DFM S30 или DFM h40 Cross. Также, Вы можете получить всю необходимую информацию об автомобилях данной марки:

• комплектации;
• технические характеристики;
• цены;
• адреса салонов Иском;
• последние новости об акциях и скидках;
• сервисное обслуживание.

Перед приобретением автомобиля Вы, также, можете познакомиться с ним поближе. Eastcom с радостью организует для Вас тест-драйв. А цена автомобиля Dongfeng станет для Вас приятным сюрпризом, ведь по сравнению с другими марками, ДунФэн самая выгодная партия. При этом уровень оснащения автомобилей на высоком уровне. Современные опции и программы сделают Вашу поездку комфортной и безопасной. Среди большого количества преимуществ DFM можно выделить следующие:

• прекрасная система безопасности. Подтверждение тому многочисленные краш-тесты;
• экстерьер и интерьер, исполненный в европейском стиле;
• комфорт на российских дорогах. Разговор идет как о состоянии дорожного покрытия, так и о погодных условиях.

Купить китайский автомобиль Dongfeng в Санкт-Петербурге теперь может каждый. Для этого Вам потребуется всего лишь приехать в наш салон или оставить заявку на нашем сайте!

Отзывы владельцев DongFeng h40 Cross (Донгфенг АШ30 кросс) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев DongFeng h40 Cross (Донгфенг АШ30 кросс) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—Купил после ремонта. Не работает кондиционер, парктроники. Музыка штатная — просто хлам. Нет магазинов с запчастями в регионе.

11 комментарий

Владею с начла 2016 года, к концу лета 2017 пробег 47 000 км. Надёжность на отлично! Проехал половину Кавказа и всю Среднюю Азию на этом автомобиле, ничег оне гремит, не болтается, все системы…

6

В городском потоке автомобиль выделяется внешним видом, особенно в вечернее время при включенных габаритах. Пластиковые накладки лучше уменьшить по ширине до 30-50 мм, а настоящие, при таких колесах…

1

В покупке разочарован, повелся на комплектацию, которая недоступна на других моделях за такие деньги. Машина подойдет для работы, но не для личного пользования. Кроме подвески и света никаких плюсов…

82 комментария

Авто купил весной в 2015 году, можно сказать — случайно. Изначально шел в салон посмотреть и возможно купить новый распродажный Шевроле Круз. Но, увидел в салоне необычный автомобиль с непонятным…

2411 коментариев

Купили авто в декабре 2015, катаемся много и я, и супруга, накатали 33 000 км. До этого был Hyundai с пробегом в 8 лет. В принципе на покупку было около 600 тысяч, ну и хотелось кроссовер, посему…

125 коментариев

Приобрёл авто в конце августа 15г. Общее впечатление за эти деньги отличный выбор.Высокий клинерс ,добротно сделанный просторный салон,багажник конечно не оч.большой, хорошая управляемость, подвеска…

142 комментария

Добрый день, купил DFM h40 в январе 2016, пробег на сегодня 2650 км., поэтому особо сказать и нечего так общее впечатление, собираюсь на ТО, результаты отпишу. Присматривался очень долго, выбирал…

1310 коментариев

Приобрел данный авто у официального дилера в г.Орск. За 11тыс.км пробега больших недостатков не обнаружено. Трасса на круизе с климатом превосходно! Расход 7.8 — 8.2 по трассе. Город 9.0 — 10.5…

14

Покупал машину в декабре 2014 года в люксовой комплектации, как вторую для супруги, но сам частенько на ней езжу (пробег 15000 км). Автомобиль не только для города. Высокий клиренс позволяет нормально…

286 коментариев

Всем доброго времени суток! В семье уже есть один автомобиль — японский кроссовер, но возникла необходимость приобретения еще одного, т.к. мне по работе всегда нужна машина, а жену в декрете с…

525 коментариев

Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Сервис ДонгФенг Н30 Кросс в Москве на Дмитровском шоссе в САО

МЫ ВСЕГДА ВАМ РАДЫ! DongFeng h40 Cross

Концепция нашего сервиса основана на предельном внимании мастеров к деталям и отношении к вашему автомобилю как к своему в процессе ремонта. Ваш ДонгФенг Н30 Кросс будет обслужен согласно требованиям данного автоизготовителя, будут поставлены подлинные расходники или же проверенные аналоги.

Ведущим направлением специализации автосервиса ОМ-Авто является ремонт и обслуживание модели DongFeng h40 Cross. Как и у многих новых автомобилей, имеется большое число манипуляций, которые рекомендовано совершать на профильном оборудовании. У нас есть все важные инструменты как для любого планового техобслуживания, так и для необычного ремонта. Мы используем современное оснащение и совершенствуем все процессы, и потому приобретаем автоматические устройства для выкачки масел в двигателях и КПП, жидкостей в радиаторе и тормозной системе.

ТО ДонгФенг Н30 Кросс

Первоочередными работами для h40 Cross являются замены фильтров и масла. Для большинства популярных автомобилей запасные части у нас имеются на складе, для других можно заказать их за несколько дней перед записью. Мы стараемся сделать всё, чтобы клиентам было удобнее, и поэтому сами закупим все детали к вашему приезду по самой низкой цене. Когда нужно объёмное техобслуживание, со снятием ремня ГРМ или другими специфическими задачами, советуем проверить наличие всех расходных материалов заранее.

Виды работ, которые выполняет наш сервис:

• плановое техническое обслуживание;
• задачи по диагностике и восстановлению ходовой части;
• восстановление кузова, полная или частичная покраска;
• ремонт двигателя, турбин, головки блока цилиндров и КПП;
• компьютерная диагностика двигателя;
• легковой шиномонтаж.

Цена на ремонт и обслуживание DongFeng h40 Cross

Все работы у нас в сервисе расписаны, мы разработали точные прайсы по ремонту автомобилей нескольких моделей, и наши клиенты могут заранее узнать общую стоимость. Более того, мы можем ответственно заявить, что у нас вы найдёте лучшее соотношение между ценой и качеством оказания услуг.

Расход топлива DongFeng h40 Cross на 100 км: реальный, средний, повышенный

При выборе автомобиля, будь он новый или подержанный, анализируется информация о слабых и сильных сторонах различных моделей. Далее наступает момент, когда предварительный анализ проведен, тут начинается углубленное изучение понравившейся машины.

В нашем случае, этой машиной является Донг Фенг Н30 Кросс, которая полностью нас устраивает своими техническими характеристиками. Но помимо основных параметров, интересной будет информация о расходе топлива у данной модели. Ведь это является наиболее большой статьей расходов при эксплуатации.

Расход топлива на 100 км Донг Фенг Н30 Кросс

Расход топлива зависит от многих факторов, таких как стиль вождения, условия эксплуатации, износ двигателя, а также других узлов и агрегатов. Также потребление топлива будет разным, из-за различных модификаций устанавливаемых силовых установок.

Рассмотрим расход при различных режимах эксплуатации на модели Донг Фенг Н30 Кросс. Все официальные данные сведем в таблицу с характеристиками.

Модель выпускалась с 2014 по 2018 и имеет одно поколение.

По трассе

На практике, режим передвижения по трассе, для DongFeng h40 Cross является наиболее экономичным вариантом езды. Это также отражается и в паспортных характеристиках, заявленных производителем для данного автомобиля.

Но стоит учитывать, что потребление топлива по паспорту, будет отличаться от расхода в реальных условиях. При заводских тестах создаются идеальные условия, а также поддерживается оптимальная скорость и обороты двигателя.

В городе

Передвижение по городу на Донг Фенг Н30 Кросс является наиболее затратным режимом в плане потребления топлива. А реальные данные, очень сильно могут отличаться от эталонных, установленных производителем.

Движение автомобиля с резкими ускорениями, частые простои на светофорах, либо во многочасовых пробках, не способствуют экономии топлива. Как, впрочем, и частые поездки на небольшие расстояния, совершаемые в течение дня.

Если исключить данные факторы, а также придерживаться спокойной езды с плавными разгонами и торможением. То вполне можно уложиться в заявленные производителем цифры, указанные в таблице ниже.

Средний (смешанный цикл)

Средний расход топлива у DongFeng h40 Cross подразумевает передвижение на автомобиле в городском и загородном цикле. Именно на него обращают внимание при выборе транспортного средства, а также при учете расходов.

Но смешанный цикл, как и приведенные выше, в реальных условиях может отличаться от эталонных, которые указывает производитель. Поэтому опираться на них в полной мере не стоит.

Обычно, опытные водители для получения более реальных цифр, советуют накидывать 10-15% к тому расходу, который указан в паспортных характеристиках.

Таблица характеристик расхода топлива DongFeng h40 Cross

Расход потребления горючего может отличаться в зависимости от модификации автомобиля. А также установленного на него двигателя, года выпуска и других факторов. Вся доступная информация структурирована в виде таблиц ниже.

Поколение 1

Первое поколение имеет обозначение (hatchback / хэтчбек), годы производства – 2014-2018.

В комплектации первого поколения DongFeng h40 Cross присутствуют бензиновые двигатели. В зависимости от объема, а также типа трансмиссии, средний расход бензина составляет от 6.9 до 7.4 литров на 100 километров.

Реальный расход

Если говорить о реальном расходе на автомобиле Донг Фенг Н30 Кросс, который получен на заводе в ходе испытаний, то он будет реальным. Другое дело, что его вряд ли получиться добиться при обычной эксплуатации транспортного средства.

Давайте разберем, почему могут отличаться заводские данные в разных источниках, даже для одной конкретной модели, ну и конечно, отзывы реальных владельцев. Можно ли им доверять или лучше провести замеры самостоятельно.

По паспорту (базовый)

Перед выпуском какой-либо модели автомобиля, он должен пройти ряд тестовых испытаний для подтверждения технических характеристик и DongFeng h40 Cross в этом не исключение. Среди них присутствует тестирование расхода топлива, данные, которые в конечном итоге увидит потребитель. До недавнего времени, для продажи в разных регионах, использовались разные измерительные циклы. Но основными считаются европейский, американский и японский:

• Для Европы используется NEDC (New European Driving Cycle), если перевести дословно, то получится Новый Европейский Ездовой Цикл. С недавнего времени, когда в Европе начал широко использоваться экологический стандарт Евро-5. Стандарты тестирования немного модифицировали и соответственно аббревиатура приобрела новый вид MNEDC.
• В США тестирование проходит по комплексу процедур, отвечающих требованиям FTP-75 (Federal Test Procedure 75). Ответственной организацией является ЕРА (Environmental Protection Agency), на русском языке имеет аббревиатуру АООС (Агентство по охране окружающей среды). Первый комплекс процедур тестирования, был разработан в 1978 году. Последние изменения датируются 2008 годом. Вообще FTP-75 это комплекс тестов, в котором непосредственно присутствует HWFET (HighWay Fuel Economy Test). Именно благодаря ему определяется количество потребляемого бензина или дизеля.
• Для тестирования в Японии, разработан свой ездовой цикл, имеющий название JC08. Но он в отличие от уже приведенных, направлен не на замеры расхода топлива, а на запас хода, который может проехать автомобиль. В принципе отличие незначительное и легко переводится в более привычные для нас величины.

Из-за разных подходов к измерению расхода топлива для разных рынков, цифры, которые мог видеть будущий владелец, могли различаться. Но с недавнего времени ситуация начала меняться, была разработана новая методика испытаний WLTP (Worldwide Light Test Procedure). Которая должна стать единой для тестирования во всех странах.

С конца 2018 года, новые, а также уже выпускаемые автомобили в Европе, должны проходить испытания уже по новой методике. Помимо Европы, автопроизводители Японии, Кореи, Индии и ряда других стран намерены перейти на методику испытаний WLTP. А вот Китай и США, пока не спешат переходить к общей системе.

Отзывы владельцев

На просторах интернета, в различных сообществах можно найти очень много противоречивой информации, по поводу расхода топлива на Донг Фенг Н30 Кросс. И не всегда получается составить объективную картину потребления на 100 километров.

Некоторые владельцы пытаются убедить других людей, что их автомобиль расходует настолько мало, что еще чуть-чуть и сам начнет вырабатывать бензин или дизель. Конечно, это стоит расценивать как абсурд, но может людям и правда повезло.

Но есть совершенно противоположные отзывы владельцев, которые жалуются, что расход чрезмерно большой. Понять причину повышенного потребления без дополнительных данных тяжело, на это могут влиять множество факторов, к которым вернемся чуть ниже.

Большинство владельцев сходятся во мнении, что автомобиль при нормальной эксплуатации в смешанном цикле должен потреблять на 10-15% больше заявленного производителем. Если данные по расходу отличаются сильнее, то это признак задуматься о неисправности. Тем более если это случается на постоянной основе.

Причины большого потребления топлива

Если говорить о повышенном расходе топлива на Донг Фенг Н30 Кросс, то существует ряд причин. Которые можно разделить на технические и эксплуатационные.

Основные технические проблемы, из-за которых возрастает расход топлива:

1. Неисправность двигателя.
2. Неправильно настроенное зажигание, забитость инжектора, либо других элементов топливной системы.
3. Некорректная работа электронной системы управления двигателем (чаще всего возникает из-за вышедшего из строя какого-либо датчика).
4. Прогоревший или забитый катализатор помимо увеличения расхода, очень сильно влияет на потерю мощности.
5. Вышедшие из строя свечи зажигания.
6. Забитые форсунки.
7. Засоренный воздушный, а также топливный фильтр.
8. Износ сцепления или автоматической трансмиссии.
9. Неисправности тормозной системы.
10. Износ покрышек или слабое давление в них.

Эксплуатационные нюансы, из-за которых возможен повышенный расход:

• Спортивный стиль вождения с резкими ускорениями, при котором двигателю приходится работать на повышенных оборотах.
• Большая загрузка автомобиля, также буксировка прицепа и использования багажника на крыше.
• Заправка машины некачественным топливом.
• Использование моторных и трансмиссионных масел большей вязкости, чем рекомендует производитель.
• Движение на непрогретом двигателе.
• Неправильный выбор размера колес или колесных дисков.
• Езда с включенными потребителями энергии, а также работающим кондиционером.

Большинство причин, по которым на Донг Фенг Н30 Кросс может проснуться жор, являются банальными и лежат на поверхности. Но для определения некоторых неисправностей может потребоваться профессиональная диагностика.

В некоторых случаях, для достижения нормального расхода, необходимо провести ряд ремонтных либо профилактических действий. При которых, поэтапно будут проверены все проблемные места, а также устранены ошибки.

Видео

Недостатки Донгфенг h40 Кросс — отзывы владельцев (все минусы и плюсы)

Все минусы Донгфенг h40 Кросс 2018

➖ Жесткая подвеска
➖ Качество материалов отделки
➖ Шумоизоляция

Плюсы

➕ Надежность
➕ Управляемость
➕ Дизайн

Достоинства и недостатки Донгфенг h40 Кросс в новом кузове выявлены на основе отзывов реальных владельцев. Более детальные плюсы и минусы Dongfeng h40 Cross с механикой и автоматом можно узнать из рассказов ниже.

Отзывы владельцев

В городском потоке автомобиль выделяется внешним видом, особенно в вечернее время при включенных габаритах. Пластиковые накладки лучше уменьшить по ширине до 30-50 мм, а настоящие, при таких колесах — не смотрятся. Да и сами колеса требуются другие, с высоким профилем!

В салоне все замечательно, но люк — лишняя вещь, очень редко используется, и за эти деньги лучше установить попогрейки, подогрев руля и лобовое стекло с подогревом.

Видно, что авто разрабатывали для себя, а для россиян (в основном 175-190 см) уже нужны другие подушки сидений — длиннее, а иначе коленки висят в воздухе, и ноги на дальних переездах сильно устают.

В мультимедиа не хватает навигации, музыка с флэшки или с диска — очень внятно, да и телефоном пользоваться удобно. Пикалка и камера очень помогают при парковке. Научился (привык) и теперь паркуюсь вплоть до 10-15 см. Настройка двигатель-автомат рассчитана на город, комфортно, без суеты.

Нуриахмет Гатауллин, ездит на Dongfeng h40 Cross 1.6 AT 2014 г.в.

Видео отзыв

Спустя два с половиной года эксплуатации, могу сказать, что h40 Cross — добротный, вполне комфортный и надежный автомобиль С-класса. Из за «длинного» руля и большого переднего свеса автомобиль больше подходит для трассы, чем для города.

Автомобиль однозначно рекомендую к покупке. Особенно, учитывая его стоимость. Надежный и ресурсный двигатель и коробка, простая по конструкции подвеска, оцинкованный кузов, дешевые расходники, минимальное количество несерьезных «детских болезней». То есть с технической точки зрения — придраться особо не к чему.

Юрий, отзыв о ДФМ Н30 Кросс 1.6 (117 л.с.) MT 2015 г.

Итак, экстерьер, он же внешний вид:
1. Качество окраски хорошее, пока нигде ничего не скололось, не поцарапалось, не зашеркалось.
2. По поводу дизайна машины до сих пор двоякое чувство: с одной стороны нравится, с другой зайдешь уже не очень, с третьей опять ничего так.
3. Немного не нравятся очень широкие пластиковые молдинги, особенно вокруг колес, т.к. колеса R16 205/60 выглядят какими-то маленькими.

Оптика:
1. Головной свет линзованый, светит достаточно неплохо плюс автокорректор, пока проблем особых не заметил ни в снег, ни в дождь.
2. Немного расстраивает отсутствие противотуманок заводских, но это дело вполне поправимое, пока руки не дошли установить.

Салон:
1. Расцветка салона у всех таких машин серая с оранжевыми вставками по середине, не айс, конечно, но все решается чехлами.
2. У обивки сидений интересная текстура-сеточка. До этого нигде такую не встречал. Тоже пойдет.
3. Пластик дубовый и в холодную погоду пока не прогреется поскрипывает. Выглядит не плохо, особенно наполированый.

В движении:
1. Реальный расход зимой с прогревами около 12 литров на 100 км в городе. На трассе больше 6,5 литров не употреблял. Летом не знаю, еще не дожил.
2. Едет достаточно неплохо, учитывая, что автомат 4-ех ступенчатый.

Отзыв о DFM h40 Cross 1.6 (117 л.с.) AT 2015 года

Владею с начала 2016 года, к концу лета 2017-го — пробег 47 000 км. Внешний вид привлекательный, надежность всех агрегатов (они все японские) — это плюс!

Проехал половину Кавказа и всю Среднюю Азию на этом автомобиле: ничего не гремит, не болтается, все системы работают на отлично. За время эксплуатации менял только расходники (масла, фильтра, колодки, свечи).

Отзыв о Dongfeng h40 Cross 1.6 АКПП 2016 г.

В покупке разочарован, повелся на комплектацию, которая недоступна на других моделях за такие деньги. Машина подойдет для работы, но не для личного пользования. Кроме подвески, просторного салона и света никаких плюсов у машины нет.

А вот недостатков полно: тупая 4-ех ступенчатая коробка, большой расход топлива, плохая шумоизоляция, маленький багажник, плохое ЛКП (на двери багажника краска отваливается кусками).

Отзыв о Донгфенг h40 Кросс 1.6 (117 л.с.) с автоматом 2016 года

Трактор Dongfeng (Донг Фенг) DF-244 NEW- цена завода / ponytractor.ru

В базовой комплектации трактор Dongfeng DF-244 NEW оснащается экономичным, четырехтактным,3-х цилиндровым дизельным 24-ти сильным двигателем (КМ 385BT) водяного охлаждения, полноприводной (4х4) механической трансмиссией (с пониженным рядом и блокировкой заднего дифференциала), счетчиком моточасов. За функционирование гидравлической системы трактора Донг Фенг ДФ-244 в новом дизайне отвечает гидронасос, критическим давлением 14 МПа. Дополнительно в базовую комплектацию входит: задний вал отбора мощности (ВОМ), задняя 3-х точечная навеска, задний гидравлический распределитель с джойстиком управления с 2-мя коннекторами (гидровыходами). Дополнительно можно до установить: фронтальные противовесы, козырек и дугу безопасности.

Удобство и комфорт управления трактором Dongfeng DF-244 NEW обеспечивает: комфортное регулируемое сиденье, гидравлический усилитель рулевого управления, классическое расположение рычагов управления, короткоходная кулиса КПП, раздельные тормозные педали, ножной иручной акселератор.

За безопасность оператора полноприводного минитрактора Dongfeng DF-244 NEW отвечает: рамная конструкция минитрактора, дуга безопасности (опция), зеркала заднего вида,. В вечернее и ночное время безопасность оператора обеспечат галогеновые фары с мощным потоком света, фонари габаритных огней, задние стоп сигналы, фонари указателей поворотов и площадка под номерной знак с подсветкой.

Надежный, экономичный, многоцелевой китайский минитрактор Dongfeng DF-244 в новом дизайне станет надежным помошником в фермерском или личном подсобном хозяйстве. Он легко вспашет плугом земельный участок до 20 Га, обработает почву фрезой — 1,4 м, посадит и соберет урожай, поможет с заготовкой сена, перевезет груз в прицепе до 1,5 т. и выполнит еще много других видов работ как в фермерском хозяйстве, так и в личном подсобном хозяйстве.

На минитрактор Донг Фенг DF-244 в новом дизайне можно установить фронтальный погрузчикфронтальный погрузчик и экскаватор.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИНИТРАКТОРА

DONGFENG DF-244 NEW красного цвета:

ОБЗОРНОЕ ВИДЕО ТРАКТОРА DONGFENG (ДОНГ ФЕНГ) DF-244 NEW

Если Вы хотите купить минитрактор Dongfeng DF-244 в новом дизайне или Вам необходима дополнительная информация по этому трактору — посмотрите отзывы о тракторе Донг Фенг в интернете или обратитесь к нашим менеджерам. Мы постараемся более подробно рассказать о тракторах и при необходимости подобрать оптимальную марку и модель трактора, который будет решать поставленные Вами задачи в рамках своих максимальных нагрузках.

Обращаем Ваше внимание, что на базе нашего магазина ТД «ПониТрактор» организована сервисная зона для гарантийного и пост гарантийного ремонта и обслуживания минитракторов Dongfeng (Донг Фенг). Наши специалисты сделают диагностику неисправности и проведут ремонтные работы любой сложности. В штате нашей компании есть выездные бригады для решения вопросов технического обслуживания и ремонта тракторовДонг Фенг на территории клиента.

Для клиентов, желающих проводить техническое обслуживание (ТО) трактора Dongfeng своими силами, предлагаем комплекты фильтров и масел (ТО-1, ТО-2, ТО-3 и т.д.). Покупая у нас комплект расходных материалов очередного ТО для мини трактора Донг Фенг — Вы можете быть уверены, что приобретаете оригинальные запчасти и масла рекомендованные заводом производителем. Цена полного комплекта ТО при этом будет значительно дешевле, чем если покупать расходные материалы по отдельности.

В случае необходимости можем отправить запчасти и/или комплект ТО для минитрактора Dongfeng любой транспортной компанией до Вашего населенного пункта.

Приезжайте к нам в магазин! Или заказывайте удаленно с доставкой до Вашего населенного пункта минитрактор Донг Фенг, а также запчасти или комплект ТО к нему!

ВИДЕО — СРАВНЕНИЕ МИНИТРАКТОРА DONGFENG DF-244 C БЛИЖАЙШИМ КОНКУРЕНТОМ JINMA 264E:

Донг Фэн-3 (CSS-2) — Альянс пропаганды противоракетной обороны

Факты

Китай / США. Обозначение	DF-3 / CSS-2
Варианты ракет	DF-3A
Мобильность и роль	Баллистическая ракета шахтного базирования / средней дальности
Дизайнер / Продюсер	Китайская Народная Республика
Диапазон	3,000 км
Тип и масса боевой части	Ядерная или обычная техника / 2000 кг
MIRV и доходность	Нет возможности MIRV / 700kt
Система наведения / точность	инерционный / 1000-4000 м CEP
Ступени / топливо	Одинарный / жидкий
IOC / Пенсионный	1971 / Действует
Статус / количество единиц	В рабочем состоянии / НЕТ

Обзор

Разработанная как первая современная китайская ракета, DF-3 имеет дальность действия до 3000 км и была принята на вооружение в 1971 году.В шахтной одноступенчатой ​​БРСД используется жидкое топливо и инерционная система наведения. [I] DF-3 и его улучшенный вариант DF-3A в значительной степени были заменены DF-21 и только минимальной. Есть предположения, что сегодня существует некоторое количество ракет DF-3. Многие устаревшие ракеты DF-3 также были переданы на аутсорсинг в Саудовскую Аравию.

DF-3A — это модернизированный вариант DF-3, который был введен в эксплуатацию в августе 1988 года. Как и DF-3, DF-3A не обладает значительными возможностями для передвижения по дорогам, однако он развертывается с помощью буксируемой пусковой установки.Усовершенствованная ракета обладает дальностью до 4000 км и более точной системой наведения, чем DF-3. Обе ракеты имеют одинаковое топливо, диаметр и время горения, однако DF-3A имеет улучшенную версию двигателя YF-2. [Ii]

Стратегические последствия

Будучи первой китайской ракетой, способной достичь США, базирующейся в Первой цепи островов, БРСД предоставила Китаю множество новых возможностей и возможностей для нанесения ударов. DF-3 также предоставил Китаю возможность успешно запускать космические аппараты и спутники, такие как CSL-1 и CZ-1.[iii] Установление Китая в качестве силы, с которой нужно считаться в отношении баллистических ракет, DF-3 и DF-3A доказали, что Китай обладает технологическим потенциалом для производства БРСД, и предоставили Китаю возможность расширить диапазон их A2 / AD. Это также проложило путь для многих достижений Китая в области баллистических ракет, таких как D-21 и несколько ее вариантов. [Iv]

---

Источники

[i] http://www.ausairpower.net/APA-PLA-Ballistic-Missiles.html#mozTocId62206

[ii] http: // www.b14643.de/Spacerockets/Specials/DF-3/index.htm

[iii] https://fas.org/nuke/guide/china/theater/df-3a.htm

[iv] http://www.deagel.com/Ballistic-Missiles/DF-3_a002120001.aspx

Справочник по ядерным силам

ПРО: Противоракетная ракета; КРВБ: крылатая ракета воздушного базирования; DF: Донг Фэн; МБР: Межконтинентальная баллистическая ракета; БРСД: баллистическая ракета средней дальности; JL: Джуланг; LACM: крылатая ракета Land-Attack; БРСД: баллистическая средняя дальность Ракета; БРПЛ: баллистическая ракета морского базирования; SLCM: Морской круиз Ракета; SRBM: баллистическая ракета малой дальности; ПЛАРБ: Ядерная баллистическая Ракетная подводная лодка; ТД: Тэпо Донг. a Бомбардировщик B-1B больше не ядерный. Это было официально был исключен из SIOP в 1997 году, но оставался в Плане ядерного переворота до марта 2003 года, когда канцелярия секретаря Министерство обороны приказало ВВС США прекратить выполнение этого плана. B-1B больше не способный к ядерному оружию. b Первая ПЛАРБ типа «Борей» была запущена в 2006 г. и может в 2008 г. вступит в строй с БРПЛ «Булава». Всего шесть ПЛАРБ «Борей». планируются. Дельта IV модернизируются до доработанного SS-N-23 (Sineva).Все, кроме трех из первоначальных шести ПЛАРБ класса «Тайфун», имеют был на пенсии. Один переделан в испытательную стартовую площадку для SS-N-30. (Булава) КРМБ. Borey, вероятно, заменит Delta III на индивидуальной основе. c Пентагон объявил в мае 2007 года, что DF-31 достиг «начальной угрозы». в 2006 году. d Первый Jin-class (Тип 094) был спущен на воду в 2004 году и впервые был замечен на коммерческих спутниковых снимках в июле 2007 года.Второй ПЛАРБ типа «Джин» имеет был запущен, а третий, похоже, находится в стадии строительства. Военно-морской флот США интеллект прогнозировал, что Китай может построить пять ПЛАРБ, если он хочет иметь больше постоянное средство сдерживания морского базирования, а также отчет Министерства обороны США в марте 2008 года о том, что к 2010 году китайские силы могут иметь «до пяти» ПЛАРБ типа «Цзинь». e Министерство обороны сообщило в 2008 году, что 50–250 DH-10 были развернуты в воздушной и наземной версиях. Только часть сил H-6, возможно, 30 самолетов, по оценкам, имеют вторичную ядерную миссию.H-6 модифицируется для перевозки DH-10. Q-5 больше не может быть ядерным. Здесь нет достоверная информация о том, что новым тактическим самолетам присвоено ядерное роль.

Карбонатный аналог для анаэробного окисления метана под действием сульфатов | Геология

Было показано, что анаэробное окисление метана под действием сульфатов (SD-AOM) потребляет 90% или более метана, образующегося в подземных средах морского дна (например,г., Niewöhner et al., 1998; Knittel, Boetius, 2009). В богатых метаном морских отложениях окисление метана в первую очередь связано с восстановлением сульфатов, которое опосредуется консорциумом анаэробных метанотрофных архей и сульфатредуцирующих бактерий (Boetius et al., 2000). Хотя известно, что другие акцепторы электронов способны поддерживать анаэробное окисление метана, SD-AOM поддерживает некоторые из самых богатых морских экосистем вдоль современных континентальных окраин на участках, называемых выходами метана (например.г., Боэтиус, Венцхёфер, 2013). Было показано, что скорость сульфатредукции в отложениях с просачиванием метана может быть на несколько порядков выше, чем в отложениях без просачивания (Aharon, Fu, 2000; Joye et al., 2004). Сульфат, акцептор электронов, может изменять свои концентрации, потоки и стабильные изотопные составы серы и кислорода во время SD-AOM (Aharon, Fu, 2000; Joye et al., 2004; Bowles et al., 2014). Однако процессы SD-AOM могли быть незначительными в геологическом прошлом, когда концентрация сульфатов была низкой (Bristow and Grotzinger, 2013).Таким образом, геологическая запись SD-AOM может предоставить информацию об эволюции окружающей среды на поверхности Земли и, в частности, о концентрации сульфатов в палеоокеанах.

Составы стабильных изотопов кислорода и серы растворенного сульфата (δ ¹⁸ O _{SO 4} и δ ³⁴ S _{SO 4} ) в современных осадочных поровых флюидах, подверженных как органотрофному, так и метанотрофному микробному восстановлению сульфата, имеют были проанализированы для изучения соответствующих режимов работы (например,г., Böttcher et al., 1998, 2001; Аарон и Фу, 2000; Antler et al., 2013, 2014, 2015; Deusner et al., 2014; Ренни и Турчин, 2014). Antler et al. (2015) обнаружили, что SD-AOM в богатых метаном средах приводит к отчетливо малым δ ¹⁸ O _{SO 4} / δ ³⁴ S _{SO 4} наклонов (0,24–0,4), которые отличаются от более крупные склоны, характерные для органотрофного восстановления сульфатов или участков диффузионного потока метана в морских отложениях. Было высказано предположение, что месторождения барита могут быть потенциальным заместителем для изучения геологических данных АОМ (например,г., Бёттчер и Парафинюк, 1998; Торрес и др., 2003). Однако аутигенный барит относительно редок в отличие от карбоната в современных выходах и в древних месторождениях выходов (Peckmann, Thiel, 2004; Campbell, 2006). Аутигенный карбонат обычно образуется как в условиях контролируемой диффузией метана, так и в условиях, богатых метаном (Luff and Wallmann, 2003), а карбонатные минералы могут сохранять сульфат поровой воды в виде сульфата, связанного с карбонатом (CAS; Staudt and Schoonen, 1995). Сообщалось, что карбонаты просачивающегося метана встречались на протяжении большей части истории Земли (например,г., Пекманн и Тиль, 2004; Campbell, 2006), а их изотопные сигнатуры углерода и кислорода отражают участие метана в аутигенезе, обусловленном сульфатредукцией.

Чтобы проверить, действительно ли изотопный состав CAS из просачиваемых карбонатов обнаруживает специфический, характерно небольшой угол наклона δ ¹⁸ O _{SO 4} / δ ³⁴ S _{SO 4} , мы провели исследование δ ¹⁸ O _CAS -δ ³⁴ S _CAS пары данных из трех современных (Мексиканский залив; Черное море; Южно-Китайское море) и двух древних (неоген, север Италии; палеоген, западный штат Вашингтон, США) просачивающиеся провинции (рис.1). Основное внимание уделяется просачивающимся карбонатам из Мексиканского залива, где было доступно большое количество образцов, представляющих различные типы просачивания, а присутствие минералов арагонита и кальцита позволило провести анализ состава CAS по конкретным минералам.

Аутигенные карбонаты, использованные для этого исследования, ранее показывали, что представляют собой морские залежи углеводородов (материалы см. В хранилище данных GSA ¹ ).Современные образцы Мексиканского залива подразделяются на две группы в зависимости от преобладания арагонита или кальцита. Образцы чистых карбонатов были проанализированы на содержание CAS, δ ¹⁸ O _CAS , δ ³⁴ S _CAS , содержание пирита, δ ³⁴ S _пирит , δ ¹³ Карбонат C , δ ¹⁸ O _{карбонат} и ⁸⁷ Sr / ⁸⁶ Sr _{карбонат} (аналитические методы см. В хранилище данных).Используемые экспериментальные процедуры гарантировали, что наблюдаемые структуры стабильных изотопов CAS представляют первичные сигнатуры, отражающие сульфат поровой воды на соответствующих участках просачивания.

Общая δ ¹⁸ O _CAS / δ ³⁴ S _{Наклоны CAS} более или менее параллельны для современных образцов (Мексиканский залив и Черное море), образцов неогена и образцов палеогена с наклонами 0.28 (R ² = 0,81, n = 52), 0,29 (R ² = 0,89, n = 5) и 0,32 (R ² = 0,94, n = 5) соответственно (рис.2). На графике образцов Мексиканского залива, который различает минералогию арагонита и кальцита, изотопные данные CAS для арагонита и кальцита имеют наклон 0,53 (R ² = 0,81, n = 12) и 0,30 (R ² = 0,80, n = 38) соответственно, причем массив арагонита попадает на линию с сульфатом морской воды открытого океана (δ ¹⁸ O = 8.7 ‰ и δ ³⁴ S = 21.2 ‰; Johnston et al., 2014; Рис. 3), тогда как массив кальцита проецируется на более высокие значения δ ¹⁸ O и δ ³⁴ S.

Содержание CAS в арагоните и кальците в Мексиканском заливе широко варьируется и не имеет видимой закономерности, сгруппировавшись в среднем около 249 частей на миллион (± 145, 1 стандартное отклонение [SD], n = 12) и 188 частей на миллион (± 141, 1 SD, n = 38) соответственно (таблица DR2 в хранилище данных). Содержание CAS в двух высокомагнезиальных кальцитах Черного моря довольно низкое, от 82 до 93 частей на миллион.Карбонаты просачивания неогена из северной Италии имеют более низкие содержания CAS, чем карбонаты просачивания палеогена из западного штата Вашингтон, но все они попадают в диапазон концентраций CAS образцов Мексиканского залива.

Отношения ⁸⁷ Sr / ⁸⁶ Sr в 40 пробах из Мексиканского залива находятся в диапазоне от 0,708357 до 0,710214 (рис. 4). В этом наборе образцов образцы арагонита (0,709154–0,709205) обычно показывают значения, близкие к значениям современной морской воды (0.709175; Fu and Aharon, 1998), тогда как образцы кальцита сильно различаются: от 0,708357 до 0,710124.

Графики δ ¹⁸ O _CAS -δ ³⁴ S _CAS современных и древних карбонатов просачивания метана показывают не только сильные корреляции, но, что более важно, характерный наклон ∼0,3. Этот наклон находится на нижнем конце диапазона наклона δ ¹⁸ O / δ ³⁴ S (0.29–0,47), наблюдаемый для сульфата поровой воды в современных богатых метаном средах, и значительно отличается от наклона ≥0,4 для сульфата поровой воды в средах с контролируемой диффузией метана или без метана (см. Antler et al., 2015 ). Antler et al. (2015) пришли к выводу, что наклон не зависит от физических параметров окружающей среды (например, температуры, давления воды, солености и концентрации сульфатов), и наши результаты подтверждают этот вывод. Все типы просачиваемых карбонатов, проанализированные в этом исследовании, независимо от местоположения или возраста, демонстрируют небольшие и постоянные отклонения δ ¹⁸ O _CAS / δ ³⁴ S _CAS (0.28–0,32; Рис. 2) за исключением чистого арагонита (0,53; рис. 3). Это наблюдение предполагает, что извлеченный КАС из просачиваемых карбонатов сохранил сигналы первичных изотопов сульфата поровой воды.

Во время сульфатредукции ³⁴ S и ¹⁸ O ведут себя по-разному. Значение δ ³⁴ S _{SO 4} обычно увеличивается по мере того, как изотоп ³² S перегоняется в восстановленные продукты и фиксируется в форме сульфидов металлов с низкой растворимостью.Значение δ ¹⁸ O _{SO 4} также увеличивается, но имеет тенденцию к достижению изотопного равновесия кислорода с окружающей водой, потому что частицы серы в промежуточном валентном состоянии, которые образуются во время микробного восстановления сульфата, обмениваются своими атомами кислорода с водой (например, Fritz et al., 1989; Brunner et al., 2005; Wortmann et al., 2007; Wankel et al., 2014). Численные модели Antler et al. (2015) подтвердили, что наклоны δ ¹⁸ O / δ ³⁴ S сульфата поровой воды в богатых метаном средах варьируются от 0.24–0,4, где до 12% промежуточных продуктов восстановленной серы повторно окисляется до сульфата посредством внутриклеточного диспропорционирования промежуточных продуктов полисульфида. Однако, когда перенос метана контролируется диффузией, наклон δ ¹⁸ O / δ ³⁴ S увеличивается до> 0,4.

На первый взгляд, изученные выборки трех разных возрастных групп представляют собой параллельные массивы. Может возникнуть соблазн сделать вывод, что каждый из массивов указывает на соответствующий одновозрастной состав сульфата морской воды δ ³⁴ S и δ ¹⁸ O; однако такой вывод может быть неверным.Сульфат морской воды палеогена мог иметь несколько иной изотопный состав, чем сульфат современной морской воды (Wortmann, Paytan, 2012; Algeo et al., 2015), но вряд ли разница была большой. Более вероятное объяснение параллельных массивов состоит в том, что разные просачивания имеют разные потоки метана, что приводит к различным диапазонам глубин для богатых метаном поровых флюидов. Выше этих глубин отложения имеют ограниченную диффузию метана или даже не содержат метана. В средах, характеризующихся активным просачиванием метана, где переходная зона сульфат-метан обычно расположена близко к границе раздела отложений и воды, δ ¹⁸ O _{SO 4} -δ ³⁴ S _{SO 4} изотоп Массив будет указывать на значение изотопа сульфата морской воды.Однако, когда богатые метаном условия заканчиваются на глубине, массив δ ¹⁸ O _{SO 4} -δ ³⁴ S _{SO 4} должен указывать на изотопный состав сульфата на той конкретной глубине, где оба значения δ ¹⁸ O _{SO 4} и δ ³⁴ S _{SO 4} должны быть выше, чем у морской воды того же возраста. Эта интерпретация независимо подтверждается данными CAS по образцам арагонита и кальцита из Мексиканского залива, поскольку широко распространено мнение, что кальцит имеет тенденцию образовываться на большей глубине, чем арагонит, на просачиваниях (например.г., Haas et al., 2010; Нётен и Кастен, 2011). Больший наклон массива арагонита (0,53) δ ¹⁸ O _CAS -δ ³⁴ S _CAS попадает на линию с современным сульфатом морской воды, но меньший наклон кальцита (0,30) не выступает в изотопный состав сульфата морской воды (рис. 3). Если интерпретация, согласно которой наклон указывает на состав исходного сульфата, верна, это согласуется с широко принятой концепцией, согласно которой арагонит предпочтительно выпадает в осадок на меньшей глубине, чем кальцит.Наш набор данных подкрепляет эту концепцию двумя линиями доказательств. (1) Отношения арагонита ⁸⁷ Sr / ⁸⁶ Sr сгруппированы вокруг соотношений морской воды, тогда как соотношения кальцита значительно отклоняются от соотношений современной морской воды Мексиканского залива (рис. морское дно, тогда как кальцит образовывался на большей глубине. (2) Арагонит имеет более высокое содержание КАС, чем кальцит (Таблица DR2), что согласуется с более высокими концентрациями сульфатов в поровых флюидах и формировании на небольшой глубине осадка.

Было высказано предположение, что CAS регистрирует изотопный состав сульфата одновозрастной морской воды без видимого фракционирования ни по изотопам кислорода, ни по изотопам серы (например, Burdett et al., 1989; Lyons et al., 2004). Наши данные, однако, предполагают, что CAS диагенетических карбонатов не представляет собой сульфат окружающей морской воды, а фактически является сульфатом поровой воды. Таким образом, CAS в просачиваемых карбонатах (это исследование) и диагенетических карбонатах из богатых органическим веществом сред (Rennie and Turchyn, 2014), по-видимому, отражает изменения в концентрации сульфата в поровой воде, сигнатуры стабильных изотопов которого были изменены в разной степени, чем сигнатуры стабильных изотопов Одновременный сульфат морской воды в ходе сульфатно-зависимых биогеохимических процессов (рис.DR2 в репозитории данных).

Сущность просачивания заключается в том, что интенсивность потока жидкости сильно варьируется как в пространстве, так и во времени. Ранее предполагалось, что карбонатная минералогия и липидные биомаркеры могут быть использованы для реконструкции интенсивности фильтрации (например, Peckmann et al., 2009; Haas et al., 2010; Nöthen and Kasten, 2011). Однако, поскольку карбонатная минералогия и биомаркеры склонны к диагенетическим изменениям (см.Peckmann and Thiel, 2004), будет сложно, а иногда и невозможно использовать их в палеокарбонатных отложениях для определения интенсивности палео-просачивания или геологических процессов SD-AOM в целом. Наше исследование теперь демонстрирует, что CAS в просачиваемых карбонатах сохраняет сигнатуры стабильных изотопов сульфата по спектру интенсивностей просачивания.

Среда, богатая метаном, широко распространена вдоль окраин континентов в областях, представляющих не только выходы метана, но и другие среды, богатые органическим веществом, такие как регионы с высокой продуктивностью и апвеллингом (например.г., Шульц, 2006). Если аутигенные карбонаты встречаются в этих средах, большое отношение δ ¹⁸ O / δ ³⁴ S (или наклон) обычно указывает на окислительно-восстановительное состояние, связанное с органическим веществом и сульфатом, тогда как небольшой наклон указывает на окислительно-восстановительное состояние, связанное с сульфатом метана. Таким образом, новый прокси на основе карбонатов может быть использован для реконструкции прошлых условий осадконакопления. Новый геологический прокси, успешно протестированный в этом исследовании, представляет собой многообещающий инструмент для реконструкции активности и пространственного распределения SD-AOM на протяжении большей части истории Земли.

Анализ изотопов кислорода и серы CAS в карбонатах из трех современных и двух древних метановых провинций показал, что CAS точно записывает характерный изотопный отпечаток SD-AOM, то есть небольшой наклон δ ¹⁸ O _CAS / δ ³⁴ S _{Массив данных CAS} . Сульфат в просачиваемых карбонатах образовался из поровых флюидов, а не из морской воды. В зависимости от потока метана, переходная зона сульфат-метан располагается на разной глубине отложений.Если SD-AOM встречается на небольшой глубине осадка в поровой воде с составом морской воды, результирующий небольшой наклон δ ¹⁸ O _{SO 4} -δ ³⁴ S _{SO 4} значений лежит на линия с составом одновозрастного сульфата морской воды. Если SD-AOM находится глубже в отложениях, еще меньший наклон лежит на линии с составом сульфатной поровой воды на нижнем левом конце, что соответствует более высоким значениям δ ³⁴ S и δ ¹⁸ O, чем у морская вода.Различия в моделях CAS арагонита и кальцита из просачиваемых карбонатов Мексиканского залива подтверждают эту интерпретацию, показывая, что новый прокси также можно использовать для восстановления интенсивности потока и выявления различных окислительно-восстановительных сред в просачиваемых водах или других участках, где произошел SD-AOM. Периоды повышенного потока метана могли неоднократно происходить в современных и древних океанах. Новый прокси стабильного изотопа CAS поможет идентифицировать и лучше ограничивать активность SD-AOM на протяжении всей геологической записи.

проб из Мексиканского залива было собрано в ходе проектов, финансируемых Бюро управления океанской энергией США и Национальной программой подводных исследований Национального управления океанических и атмосферных исследований США. Мы благодарим редактора Джеймса Шмитта, Сабину Кастен и двух анонимных рецензентов за содержательные комментарии к рукописи. Финансирование было предоставлено Фэну Национальным научным фондом Китая (гранты 41373085 и 41422602), Программой сотни талантов Китайской академии наук, а также частично от университета У.S. Грант Национального научного фонда (EAR-1251824) Бао.

¹ Элемент хранилища данных GSA 2016336, описание проб и аналитических методов, результаты обогащенных пиритом образцов (Рисунок DR1 и Таблица DR1), график изотопных значений просачиваемых и непросачиваемых карбонатов (Рисунок DR2) и сводка геохимических данные (таблица DR2) доступны в Интернете по адресу http://www.geosociety.org/pubs/ft2016.htm или по запросу в редакторе @ geosociety.орг.

© Авторы

Золото Открытый доступ: Эта статья опубликована в соответствии с условиями лицензии CC-BY.

Определяющий фактор для предпочтения насекомых в питании тутового шелкопряда Bombyx mori

Abstract

Кормление имеет решающее значение для адаптации и выживания насекомых. Однако мало что известно об определении предпочтений насекомых в питании, а генетическая основа плохо изучена.В качестве модельного насекомого-чешуекрылого, имеющего экономическое значение, домашний шелкопряд, Bombyx mori , является хорошо известным монофагом, который преимущественно питается свежими листьями тутового дерева. Это видоспецифическое предпочтение кормления обеспечивает отличную модель для исследования отбора насекомых-растений-хозяев, хотя молекулярный механизм, лежащий в основе этого явления, остается неизвестным. Здесь мы описываем ген GR66 , который кодирует предполагаемый рецептор горького вкуса (GR), который отвечает за специфические для шелковицы пищевые предпочтения B . Мори . С помощью системы на основе транспозонов, сгруппированных с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированной протеин-9 нуклеазы (Cas9), локус GR66 был генетически мутирован, и гомозиготные мутантные штаммы тутового шелкопряда с усеченным вкусовым рецептором 66 (GR66) белки. GR66 Личинки мутанта приобрели новую питательную активность, демонстрируя способность питаться рядом видов растений в дополнение к листьям шелковицы, включая свежие плоды и семена зерновых, которые обычно не потребляются шелкопрядами дикого типа (WT).Кроме того, анализ выбора питания показал, что мутантные личинки утратили свою специфичность в отношении шелковицы. В целом, наши результаты предоставляют первые генетические и фенотипические доказательства того, что один горький GR является основным фактором, влияющим на предпочтение насекомых в питании.

Сведения об авторе

Молекулярный механизм, лежащий в основе видоспецифичных предпочтений насекомых в питании, плохо изучен. Тутовый шелкопряд, Bombyx mori , является типичным насекомым-монофагом, питающимся растениями, но генетическая основа его знаменитых пищевых предпочтений, характерных для шелковицы, неизвестна.Здесь мы идентифицируем вкусовой рецептор 66 (GR66) как детерминант специфической монофагии тутового шелкопряда. GR66-мутантные личинки, образованные кластерами коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированных белков-9 (Cas9) с регулярным расположением друг друга, приобрели новую питательную активность и показали способность питаться различными видами растений, которые обычно не потребляются диким типом. (WT) животные; анализ с двумя вариантами выбора показал, что мутантные личинки утратили пищевое предпочтение шелковицы.Таким образом, наши генетические и фенотипические данные демонстрируют, что GR66 является основным фактором, влияющим на пищевые предпочтения тутового шелкопряда.

Образец цитирования: Zhang Z-J, Zhang S-S, Niu B-L, Ji D-F, Liu X-J, Li M-W, et al. (2019) Определяющий фактор для предпочтения насекомых в питании тутового шелкопряда, Bombyx mori . PLoS Biol 17 (2): e3000162. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162

Академический редактор: Анураг А. Агравал, Корнельский университет, США

Поступила: 28 сентября 2018 г .; Одобрена: 8 февраля 2019 г .; Опубликован: 27 февраля 2019 г.

Авторские права: © 2019 Zhang et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Национальный фонд естественных наук Китая (номер гранта U1738110 и номер 31572330), полученный A.T. Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: ANOVA, дисперсионный анализ; кДНК, комплементарная ДНК; CRISPR / Cas9, кластеры с регулярными интервалами между короткими палиндромными повторами / CRISPR-ассоциированной нуклеазой протеина-9; DMEM, Модифицированная среда Орла Дульбекко; ДНКаза I, дезоксирибонуклеаза I; FBS, фетальная бычья сыворотка; EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; GPCR, Рецептор, связанный с G-белком; GR, вкусовой рецептор; GRN, вкусовой рецепторный нейрон; GR66, вкусовой рецептор 66; HEK293T, эмбриональная почка человека 293Т; L5D3, третий день пятой возрастной стадии; Nos-Cas9 , pBac [IE1-DsRed2-Nos-Cas9] ; ИЛИ, обонятельный рецептор; ORF, открытая рамка чтения; qRT-PCR, количественная ПЦР в реальном времени; SAPID, программы анализа шипов для данных о насекомых; SEM, стандартная ошибка среднего; sgRNA, малая направляющая РНК; ТАЛЕН, эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции; U6-sgRNA , pBac [IE1-EGFP-U6-BmGR66-sgRNA] ; WT, дикого типа; ZFN, нуклеаза цинкового пальца

Введение

Хемосенсорные процессы, включая обоняние и вкусовые ощущения, имеют решающее значение для выбора растения-хозяина у насекомых-фитофагов [1,2].Обоняние отвечает за ориентацию хозяина, а вкус играет центральную роль в выборе хозяина [3,4]. Таким образом, вкусовые рецепторы насекомых (GR), а также обонятельные рецепторы (OR) играют решающую роль в определении предпочтений насекомых при питании. Большинство GR насекомых экспрессируются исключительно во вкусовых рецепторных нейронах (GRN) и передают сигналы через GRN, чтобы регулировать пищевое поведение насекомых [5,6]. Известно, что ГР насекомых распознают сахара, горькие соединения и нелетучие феромоны [7,8].У Drosophila melanogaster , GR5a и GR66a обнаружены в разных популяциях GRN [5]. GR5a-положительные GRN реагируют на различные сахара, а GR66a-положительные GRN реагируют на многие горькие соединения [9,10]. У бабочки, Papilio xuthus , сообщалось, что GR участвует в распознавании растения-хозяина для откладки яиц [11]. Кроме того, ГР также необходимы для обнаружения CO ₂ , питательных веществ, света и температуры [12–14]. Большое количество ГР насекомых идентифицировано у многих видов насекомых [15–24].Однако большинство GR не были функционально охарактеризованы, и роль, которую играют эти GR в предпочтениях насекомых при питании, остается неясной.

Основываясь на диапазоне выбора растения-хозяина, пищевые предпочтения насекомых-фитофагов классифицируются как монофаги, олигофаги и полифаги. Чешуекрылые, крупнейшая ветвь насекомых-фитофагов, включает в себя множество важных сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые демонстрируют большое разнообразие с точки зрения предпочтений в питании. Одомашненный тутовый шелкопряд, Bombyx mori , — полезное чешуекрылое насекомое, которое на протяжении тысячелетий вносило основной вклад в производство шелка.Одна из основных характеристик B . mori — его предпочтение в монофагном питании, а личинки тутового шелкопряда преимущественно питаются свежими листьями тутового дерева ( Morus alba L.). Сообщалось о нескольких полифагных мутантных штаммах тутового шелкопряда, которые питаются листьями различных растений, которые отторгаются нормальными шелкопрядами [25,26]. Генетический анализ одного репрезентативного штамма, Sawa-J, показал, что главный рецессивный ген в полифаге ( pph ) локус потенциально ответственен за это изменение в предпочтении питания [27].Однако молекулярный механизм, лежащий в основе предпочтения монофагного кормления B . mori неизвестно, и будут ли задействованы гены GR, предпочтение шелкопряда в питании еще предстоит определить. Недавно полный набор из 76 генов GR был идентифицирован в B . mori [28]. Среди этих генов только три сахарных GR были функционально охарактеризованы [29–31], тогда как большинство GR остались функционально идентифицированными, включая 66 предполагаемых горьких GR [28].

Биологические функции большинства ГР насекомых плохо изучены, особенно у насекомых-недрозофилид, из-за отсутствия обратных генетических подходов для изучения этих видов насекомых. Это особенно верно для видов чешуекрылых, поскольку РНК-интерференция действует с переменной эффективностью у многих видов [32]. Недавние успехи в разработке инструментов для целенаправленных манипуляций с геномом обеспечивают большие преимущества для функционального геномного исследования чешуекрылых насекомых. Эти инструменты геномной манипуляции, включая нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и систему коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами между собой (CRISPR) / CRISPR-ассоциированная нуклеаза протеин-9 (Cas9), были широко используется для создания целевых мутаций в одном или нескольких сайтах у многих организмов in vitro и in vivo [33–35].Среди этих инструментов система CRISPR / Cas9 является наиболее широко используемой системой мутагенеза из-за ее высокой мутагенной эффективности и простой процедуры. Среди чешуекрылых насекомых система CRISPR / Cas9 была успешно внедрена в B . mori [36–38], Spodoptera litura [39], Plutella xylostella [40] и Helicoverpa armigera [41].

В текущем исследовании мы исследовали генетические основы предпочтения шелковицы в питании шелковичным червем.Мы мутировали ген GR66 , который кодирует предполагаемый горький GR, в B . mori с использованием системы Cas9 / small guide RNA (sgRNA). Гомозиготные мутантные личинки GR66 продемонстрировали расширенный рацион, что указывает на то, что ген GR66 отвечает за специфическое для шелковицы пищевое поведение тутового шелкопряда. Обретение у шелкопряда новой кормовой активности будет способствовать развитию современного шелководства, а также пониманию молекулярных механизмов взаимодействия насекомое-хозяин.

Результаты

Тканеспецифическая экспрессия и клеточная локализация

GR66

Сообщалось, что существует 76 предполагаемых GR, распределенных на 16 из 28 хромосом B . mori [28]. Среди этих генов только один предполагаемый ген горького GR, GR66 , был идентифицирован как расположенный на третьей хромосоме. Геномный локус этого гена находится в предполагаемом локусе pph полифагного штамма тутового шелкопряда Sawa-J [27].Это открытие указывает на то, что GR66 может быть геном-кандидатом для локуса pph и может участвовать в питании шелкопряда. Сначала мы исследовали относительные уровни мРНК GR66 в различных тканях личинок с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Сообщалось, что большинство GR насекомых локализованы во вкусовых сенсиллах ротового аппарата личинок [28,42] (Рис. 1A). Как и ожидалось, GR66 преимущественно экспрессировался в личиночных челюстях (рис. 1В).Открытая рамка считывания (ORF) гена GR66 содержит 1140 пар оснований и кодирует полипептид из 380 аминокислот. Биоинформатический анализ показал, что белок GR66 состоит из семи трансмембранных доменов с внутриклеточным N-концом, который отличается от структур членов семейства рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR) (рис. 2B). Мы дополнительно исследовали клеточную локализацию этого белка посредством трансфекции экспрессионной плазмиды GR66, слитой с усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP), в клетки 293T млекопитающих.Результаты показали, что белок локализован на клеточной мембране (рис. 1С).

Рис. 1. GR66 экспрессия в тканях и клеточная локализация GR66.

(A) Сканирующие электронные микрофотографии голов первого возраста. Область внутри белого поля справа увеличена. (B) Относительные уровни мРНК BmGR66 в тканях Bombyx mori , определенные с помощью qRT-PCR. Тотальную РНК выделяли из антенн, губ, нижней челюсти, верхней челюсти, половых губ, грудных ног и средней кишки.РНК была преобразована в кДНК, которую использовали в качестве матрицы для количественного определения уровней мРНК BmGR66 с использованием Bmrp49 в качестве контрольного гена. Показанные данные были средним значением ± стандартная ошибка среднего ( n = 3). Базовые данные можно найти в S1 Data. (C) Фотографии клеток HEK293T, экспрессирующих слитый белок EGFP-GR66 и окрашенных DAPI. n = 32. Масштаб: 10 мкм. кДНК, комплементарная ДНК; EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; FITC, флуоресцеинизотиоцианат; GR66, вкусовой рецептор 66; HEK293T, человеческая эмбриональная почка 239T; Ls — боковые сенсиллы; Mp, верхнечелюстные щупики; Ms — медиальная сенсилла; qRT-PCR, количественная ПЦР в реальном времени; SEM, стандартная ошибка среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.g001

Рис. 2. Нокаут, опосредованный CRISPR / Cas9, и сравнение между WT и мутантами.

(A) Схематическое изображение локуса GR66 и сайтов нацеливания sgRNA. Сайты нацеливания sgRNA, а именно TS1 и TS2, расположены на смысловой цепи экзона-3 и антисмысловой цепи экзона-4 соответственно. Нацеливающая последовательность sgRNA показана черным цветом, а последовательность PAM — красным. (B) Сравнение генной структуры WT и двух гомозиготных мутантных линий.Слева: экзон-интронная структура GR66 . 3′-фрагмент экзона 3, третий интрон и 5′-фрагмент экзона 4 вырезали в обеих гомозиготных мутантных линиях. В ΔGR66-2 вырезание последовательностей вызвало мутации сдвига рамки считывания. Пунктирная красная линия указывает кодон преждевременного завершения. Справа: предсказания трансмембранного домена GR66 для WT и двух гомозиготных мутантных линий. В WT белок GR66 состоит из семи трансмембранных доменов, внутриклеточного N-конца и внеклеточного С-конца.В ΔGR66-1 усеченный белок состоит из шести трансмембранных доменов, причем N-конец и С-конец являются внеклеточными. В ΔGR66-2 усеченный белок состоит только из пяти трансмембранных доменов. Ориентация N-конца и C-конца одинакова в WT. CRISPR / Cas9, кластеры с регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами / CRISPR-ассоциированная нуклеаза протеина-9; GR66, вкусовой рецептор 66; PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; sgRNA, малая направляющая РНК; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.g002

Создание

GR66 гомозиготных мутантных линий

Чтобы исследовать потенциальное участие GR66 в питании шелкопряда, мы генетически удалили GR66 с использованием основанной на транспозонах системы мутагенеза, опосредованной Cas9 / sgRNA [37]. Две независимые трансгенные линии были созданы посредством трансформации зародышевой линии, опосредованной транспозоном. Одна трансгенная линия экспрессировала Cas9 под контролем специфичного для зародышевых клеток промотора Bmnos [37], а другая линия экспрессировала две специфичные для последовательности sgRNAs, нацеленные на GR66 (рис. 2A) под контролем промотора BmU6 . [38].Каждая линия также экспрессировала флуоресцентный маркер, производный от промотора IE1 (EGFP в линии, экспрессирующей Cas9, или DsRed2 в линии, экспрессирующей sgRNA), чтобы облегчить скрининг позитивных индивидуумов с эмбриональной стадии [37]. В гибридах F1 между линиями Cas9 и sgRNA соматический мутагенез был идентифицирован с помощью анализа на основе ПЦР и последующего секвенирования. Мутанты были созданы в одном сайте или в обоих сайтах (S1A фиг.), Что указывает на то, что успешный мутагенез был индуцирован трансгенной системой CRISPR / Cas9.Соматические мутанты GR66 не показали вредного фенотипа по сравнению с животными дикого типа (WT), что указывает на то, что нокаут GR66 не влияет на развитие и плодовитость тутового шелкопряда. Чтобы получить наследственные, нетрансгенные, гомологичные мутанты для оценки предпочтений в питании, была проведена серия стратегий скрещивания и скрининговых экспериментов на основе ПЦР (S1B фиг.), Как описано ранее [43]. Наконец, были созданы две независимые гомозиготные линии с усеченными белками GR66 (S2 фиг.).Одна мутантная линия ( ΔGR66-1 ) имела делецию геномной ДНК длиной 929 п.н. в локусе GR66 , что приводило к делеции 180 п.н. в ORF и к усеченному белку 319-а.о., который был на 60 аминокислот короче, чем Белок WT GR66 (S2 фиг.). Другая мутантная линия ( ΔGR66-2 ) имела геномную делецию длиной 931 п.н. в локусе GR66 , что приводило к делеции 182 п.н. в ORF и к белку 312-а.о., который был на 67 аминокислот короче, чем длина Белок WT GR66 (S2 фиг.). Усеченные белки GR66 мутантов ΔGR66-1 и ΔGR66-2 содержали только шесть или пять трансмембранных доменов, соответственно (рис. 2В).Поскольку усеченные белки не имели всех семи трансмембранных доменов, которые необходимы для функции мембранных белков [44,45], мы предположили, что оба мутанта лишены функций GR66 .

Пищевое поведение

GR66 мутантных шелкопрядов

В соответствии с трансгенными соматическими мутантами, гомологичные мутантные шелкопряды GR66 были полностью жизнеспособными и фертильными. Сначала мы использовали гомозиготных ΔGR66-2 недавно вылупившихся личинок пятого возраста для оценки пищевого поведения.После 24 часов голодания для повышения чувствительности к кормлению личинкам дикого типа и гомозиготным мутантным личинкам GR66-2 давали различные источники пищи в течение 24 часов (рис. 3A – 3E), а затем регистрировали увеличение веса и количества помета. (Рис. 3G и 3H). Листья дуба монгольского ( Quercus mongolica Fisch. Ex Ledeb.), Плоды яблони ( Malus domestica ) и груши ( Pyrus spp.), Семена сои ( Glycine max ) и кукурузы ( Zea mays ).Листья шелковицы также использовали в качестве контроля. И WT, и мутантные личинки поедали листья шелковицы и демонстрировали нормальное развитие (Рис. 3A и S1 Movie). Листья дуба монгольского являются известными источниками пищи тутового шелкопряда китайского дуба, Antherea pernyi , но не потребляются B . Мори . Личинки ΔGR66-2 съели листья дуба (Рис. 3B и S2 Movie), и наблюдался помет (Рис. 3H), но вес тела не увеличился значительно (Рис. 3G). Личинки ΔGR66-2 показали 15.Увеличение веса на 96% с примерно семью пометом на личинку после кормления яблоком, тогда как животные WT не пытались есть яблоко, и помета не наблюдали (Рис. 3C, 3G и 3H и S3 Movie). Кроме того, мы обнаружили, что личинка ΔGR66-2 также могла питаться грушей (рис. 3D и S4 Movie), которая принадлежит к тому же семейству, что и яблоки, а именно, розоцветным. Увеличение веса на 25,47% наблюдалось для личинок ΔGR66-2 , тогда как для животных дикого типа не наблюдалось значительного увеличения (фиг. 3G и 3H).Личинки ΔGR66-2 могли питаться как свежей соей, так и кукурузой с увеличением веса на 10,56% и 14,08% соответственно, тогда как у животных WT значительного увеличения веса не наблюдалось (рис. 3E – 3H, S5 Movie и S6 Movie. ). После кормления личинок вскрывали, чтобы подтвердить переваривание пищи, и результаты показали, что средняя кишка была заполнена остатками указанной пищи (рис. 3A’ – 3F ’). Кроме того, остатки листьев монгольского дуба проникли в переднюю часть средней кишки (рис. 3B ’), что указывает на то, что листья монгольского дуба плохо перевариваются.Это открытие также объяснило, почему вес тела не увеличился значительно (рис. 3G). Аналогичный результат был получен, когда мутантная линия ΔGR66- 1 была подвергнута анализу (S3 фиг.). Примечательно, что ни одна из личинок не могла выжить на протяжении всей стадии пятого возраста при выращивании на другой пище, кроме шелковицы (S4 Рис.), Что указывает на B . mori наиболее адаптирован к листьям шелковицы при длительном выращивании.

Рис. 3. Параметры кормления линии ΔGR66-2 были расширены.

Недавно линяющие личинки пятого возраста ΔGR66-2 после 24 часов голодания съели листья шелковицы (A), дуба монгольского (B), яблони (C), груши (D), сои (E) и кукурузы. (F). (G) ΔGR66-2 , скармливаемый яблоком, грушей, соей и кукурузой, показал значительное увеличение веса по сравнению с животными WT, получавшими те же материалы. Средняя кишка ΔGR66-2 после 24 часов голодания показала, что животные ели листья шелковицы (A ‘), дуба монгольского (B’), яблони (C ‘), груши (D’), сои (E ‘), и кукуруза (F ‘).Масштабные линейки: 50 мм в A, A ’, B, B’, C, C ’, D, D’, E, E ’, F и F’. (G) ΔGR66-2 , скармливаемый яблоком, грушей, соей и кукурузой, показал значительное увеличение веса по сравнению с животными WT, получавшими те же материалы. Личинки WT и ΔGR66-2 , питавшиеся на дубе монгольском, не показали увеличения массы тела после 24 часов кормления. (H) Количество помета (на личинку) от личинок, питавшихся шелковицей, дубом монгольским, яблоком, грушей, соей и кукурузой через 24 часа после начала кормления. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 18 тутовых шелкопрядов).Звездочки указывают на значимые различия, рассчитанные с помощью двустороннего теста t : нс (несущественно), *** P <0,001. Базовые данные можно найти в S1 Data. GR66, вкусовой рецептор 66; SEM, стандартная ошибка среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.g003

Кормление мутантов

GR66

Для дальнейшего изучения предпочтения кормления мутантов GR66 мы выполнили тест с двумя вариантами выбора на предварительно голодных личинках пятого возраста.При выборе между листьями тутового дерева и листьями монгольского дуба личинки WT проявили сильное предпочтение к листьям тутового дерева и не пытались съесть листья монгольского дуба (рис. 4A и 4A ’). Напротив, личинки ΔGR66 продемонстрировали сходные предпочтения в питании как листьями шелковицы, так и листьями монгольского дуба (фиг. 4B, 4B ’, 4C и 4C’). Кроме того, коммерческий искусственный рацион, содержащий порошок листьев шелковицы, и другой искусственный рацион, в котором отсутствовали листья шелковицы (соотношение порошка соевых бобов и кукурузного порошка 1: 1), также использовались для анализа с двумя вариантами выбора.Подобно предыдущему результату, личинки WT продемонстрировали сильное предпочтение искусственной диете, содержащей шелковицу (рис. 4D и 4D ‘), тогда как личинки ΔGR66 продемонстрировали аналогичные предпочтения при кормлении для обоих искусственных диет (рис. 4E, 4E’, 4F и 4F ‘). Эти результаты показали, что мутантные личинки GR66 утратили свою специфичность в отношении шелковицы, что позволяет предположить, что GR66 необходим для специфичного для шелковицы предпочтения кормления B . Мори .Кроме того, мы провели тесты кормления с двумя вариантами питания новорожденных личинок. Как WT, так и мутантные новорожденные личинки GR66 продемонстрировали сильное предпочтение искусственной диете, содержащей шелковицу (S5, фиг.). Хотя это фенотипическое последствие еще предстоит выяснить, мы предположили, что выбор пищи новорожденными личинками также сильно зависит от OR, потому что обоняние отвечает за ориентацию хозяина [46].

Рис. 4. Анализы с двумя вариантами выбора с недавно линяющими личинками пятого возраста.

Недавно линяющие личинки WT пятого возраста после 24 часов голодания высвобождались между листьями тутового дерева и листьями монгольского дуба через 0 (A) и 1 час (A ’). Недавно линяющие личинки пятой возрастной стадии ΔGR66-2 после 24 часов голодания высвобождались между листьями шелковицы и листьями монгольского дуба через 0 (B) и 1 час (B ’). Недавно линяющие личинки пятой возрастной стадии ΔGR66-1 после 24 часов голодания высвобождались между листьями шелковицы и листьями монгольского дуба через 0 (C) и 1 час (C ’).Недавно линяющие личинки WT пятой возрастной стадии после 24 часов голодания высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев тутового дерева и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 через 0 (D) и 1 час (D ‘). . Недавно линяющие личинки пятой возрастной стадии ΔGR66-2 после 24 часов голодания высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев шелковицы и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 через 0 (E) и 1 час. (Е ‘). Недавно линяющие личинки пятой стадии ΔGR66-1 после 24 часов голодания высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев шелковицы и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 после 0 (F) и 1 h (F ‘).Масштабные линейки: 20 мм в A, A ’, B, B’, C, C ’, D, D’, E и E ’. Каждый анализ проводили в трех повторностях (технические повторности). WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.g004

Ответ мутантов

GR66 на сладкие и горькие раздражители

Большинство GR насекомых расположены во вкусовых сенсиллах ротового аппарата личинок, и сообщалось, что медиальные сенсиллы ответственны за восприятие сладкого вкуса, а боковые сенсиллы ответственны за восприятие горького вкуса у Lepidoptera [28].Чтобы исследовать, проявляют ли мутанты GR66 измененные ответы на разные вкусы, электрофизиологический анализ записи на контактной хемосенсилле был проведен на вкусовых сенсиллах, включая медиальную и латеральную стилоконическую сенсиллу личинок пятого возраста в линии ΔGR66-2 . Сначала мы исследовали два сладких стимулятора, а именно сахарозу и мио-инозитол, в латеральной сенсилле. Не было обнаружено различий между мутантами WT и GR66 в концентрации 10 мМ, что указывает на то, что истощение GR66 не имеет отношения к восприятию этих двух сладких стимулов (S6A и S6B фиг.).Впоследствии мы исследовали два горьких вещества, а именно кофеин и салицин, в медиальной сенсилле в концентрации 10 мМ. Результаты показали, что на электрофизиологический ответ на эти два вещества не влияет истощение GR66 (S6C и S6D фиг.). Мы дополнительно проверили реакцию на кофеин и салицин в различных концентрациях, и были получены аналогичные результаты (S6E и S6F, фиг.). Эти результаты показали, что мутанты GR66 не проявляли измененных ответов на эти типичные сладкие или горькие вещества.Другие соединения в листьях шелковицы, особенно потенциальные лиганды GR66, еще предстоит идентифицировать.

Discussion

Молекулярные механизмы отбора растений-хозяев у насекомых-фитофагов еще предстоит выяснить, а то, как GR участвуют в их питании, мало изучено. Выявить молекулярный механизм, лежащий в основе шелковичных травоядных растений B . mori , мы генетически удалили предполагаемый горький GR, GR66 , с помощью Cas9 / sgRNA-опосредованного целевого мутагенеза.Гомологичные мутантные личинки продемонстрировали потерю специфичности шелковицы и способности питаться широким спектром источников пищи, что указывает на то, что GR66 является определяющим фактором предпочтения монофага в питании B . Мори .

Было идентифицировано увеличивающееся количество ГР насекомых, и сообщалось об их критической роли в обнаружении стимуляции окружающей среды [7–14]. У насекомых-фитофагов большинство зарегистрированных GR относятся к предполагаемому подсемейству горьких GR, и они необходимы для распознавания многих вторичных метаболитов растений, которые обычно являются горькими соединениями [47].В B . mori , подсемейство горьких GR содержит до 66 генов и является самым большим подсемейством среди 76 идентифицированных GR в B . mori [28]. Ни один из этих предполагаемых горьких GR не был функционально выяснен до текущего исследования GR66. Наши данные убедительно свидетельствуют о том, что GR66 является основным фактором, влияющим на пищевые предпочтения тутового шелкопряда, потому что мутация этого гена может изменить специфическое для шелковицы травоядное животное тутового шелкопряда.Мы предполагаем, что GR66 может служить ингибитором питания в B . Мори . Это открытие объясняет, почему мутагенез GR66 может привести к принятию личинками расширенного диапазона материалов растения-хозяина. У животных WT GR66 активен и подавляет пищевое поведение на материалах, не являющихся хозяевами, тогда как определенные соединения в листьях шелковицы прямо или косвенно подавляют активность GR66, что приводит к инициированию такого пищевого поведения. Дальнейшая проверка потенциальных лигандов GR66 в листьях шелковицы и идентификация пищевых компонентов, которые определяют специфичность хозяина, будут иметь решающее значение для выяснения этого видоспецифичного предпочтения кормления.В текущем исследовании штаммы ΔGR66 не показали значительных электрофизиологических различий в выборе сладких или горьких веществ, включая салицин. Наши результаты отличались от ранее опубликованных результатов для многоядного штамма тутового шелкопряда Sawa-J, который показал пониженную чувствительность к горькому соединению салицину [26]. Поскольку локус pph в штамме Sawa-J не был картирован с одним геном [26], различные электрофизиологические фенотипы между штаммами Sawa-J и ΔGR66-2 указывают на предполагаемое участие различных или дополнительных генов. , такие как многие другие гены GR в B . mori , следует принимать во внимание, чтобы объяснить предпочтение тутового питания монофагами. Мы предположили, что эффекты этих генов привели к штамму Sawa-J и мутантам GR66 , проявляющим разные ответы на салицин. Кроме того, возможно, что мутагенез GR66 и не привел к созданию полностью нулевых мутантов (рис. 2), и укороченный GR66 все еще может отвечать на салицин.

Листья шелковицы использовались как единственный источник пищи для массового выращивания тутового шелкопряда на протяжении тысячелетий.Из-за ограничений, связанных с трудозатратами и потреблением земли, а также сезонными циклами сбора свежих листьев шелковицы, продолжалась разработка штаммов тутового шелкопряда, которые могут питаться экономически эффективными диетами вместо листьев шелковицы. Превращение монофага тутового шелкопряда в многоядный вид посредством мутагенеза GR представляет собой многообещающий подход к разработке альтернативных источников пищи для массового выращивания тутового шелкопряда. Кроме того, чешуекрылые насекомые включают большое количество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые демонстрируют большое разнообразие с точки зрения привычек питания.Ортологические гены GR66 или других GR у чешуекрылых насекомых могут играть ключевую роль в видоспецифичных предпочтениях питания этих насекомых. Предпочтение насекомых при кормлении — очень сложный биологический процесс и, вероятно, более сложный, чем определяется одним геном. Функционально большое количество ГР насекомых еще предстоит выяснить, и их также следует рассматривать как играющие важную роль в предпочтении кормления. Выяснение критической роли ГР в предпочтении насекомых при питании даст представление о механизмах, лежащих в основе пищевого поведения насекомых и взаимодействия насекомых-растений, что будет способствовать разработке новых стратегий борьбы с вредителями.

Материалы и методы

Шелкопряды

Мультивольтинный и монофагный штамм тутового шелкопряда Nistari использовался во всех экспериментах. Личинок кормили свежими листьями шелковицы при 25 ° C в стандартных условиях [48].

Сканирующая электронная микроскопия

Головы были вырезаны из только что вылупившихся личинок первого возраста B . Мори . Вырезанные головки промывали PBS и фиксировали раствором FAA (соотношение 37-40% формальдегида, ангидрида уксусной кислоты и 50% этанола 1: 1: 18).Фиксированные образцы обезвоживались путем воздействия постепенно возрастающих концентраций этилового спирта (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) с использованием роторной машины. Головки сушили в сушилке для критических точек, а затем покрывали платиной перед наблюдением под растровым электронным микроскопом (JEOL).

qRT-PCR

Тотальную РНК выделяли из антенн, губ, нижней челюсти, верхней челюсти, половых губ, грудных ног и средней кишки личинок третьего дня пятого возраста (L5D3) с использованием реагента TRIzol (Invitrogen).РНК обрабатывали ДНКазой I (Invitrogen) для удаления геномной ДНК. Один микрограмм общей РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Относительные уровни мРНК определяли с помощью qRT-PCR с использованием мастер-микса SYBR Green для ПЦР в реальном времени (TOYOBO). Используемые условия ПЦР были следующими: начальная инкубация при 95 ° C в течение 1 мин, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 с и 60 ° C в течение 1 мин. Праймеры, используемые для qRT-PCR, перечислены в таблице S1. Другая пара праймеров, а именно RP49-F и RP49-R (таблица S1), использовалась в качестве внутреннего контроля [48].

Молекулярное клонирование и конструирование плазмид

ORF BmGR66 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием кДНК, синтезированной из общей РНК, выделенной из верхних челюстей на L5D3, в качестве матрицы. Полученные продукты ПЦР были непосредственно клонированы в вектор pcDNA-3.0 для получения GR66-pcDNA3.0. Для обнаружения экспрессии BmGR66 в клетках 293T (HEK293T) почки человека, ORF GFP была клонирована и включена в рамку считывания перед BmGR66 с гибким линкером, модифицирующим аминокислоты GGGGS.Для создания трансгенной системы CRISPR / Cas9 мы использовали активаторную линию pBac [IE1-DsRed2-Nos-Cas9] ( Nos-Cas9 ), в которой Cas9 управлялся промотором, специфичным для зародышевых клеток, как описано ранее [37]. Плазмида pBac [IE1-EGFP-U6-BmGR66-sgRNA] ( U6-sgRNA ), используемая для экспрессии sgRNA, была сконструирована, как описано ранее [38]. Сайты нацеливания sgRNA были разработаны как GN19NGG. Праймеры, используемые для конструирования плазмид, перечислены в таблице S1.

Культура клеток и трансфекция

Клетки

HEK293T культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Для анализа локализации рецептора клетки HEK293T высевали в 35-мм стерилизованные чашки со стеклянным дном и инкубировали в течение 24 часов. EGFP-GR66-pcDNA3.0 трансфицировали в клетки HEK293T с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 24 часа клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут и, наконец, инкубировали с DAPI в течение 10 минут.Клетки визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Zeiss LSM 510, присоединенном к микроскопу Zeiss Axiovert 200 с использованием масляной иммерсионной линзы Zeiss Plan-Apochromat 63 × / 1,40 NA.

Трансформация зародышевой линии и анализ мутагенеза

Трансформацию зародышевой линии тутового шелкопряда проводили, как описано ранее [48]. Для трансгенной системы CRISPR / Cas9 линия Nos-Cas9 была скрещена с линией U6-sgRNA , и геномная ДНК была извлечена из Nos-Cas9 : U6-sgRNA, как описано ранее [38].Затем была проведена геномная ПЦР с последующим секвенированием для идентификации мутантных аллелей GR66 .

Стратегия скрининга и определение гомозиготных мутантных штаммов

Для создания стабильной гомозиготной мутантной линии Nos-Cas9 : U6-sgRNA (F1) скрещивали с WT. Для потомства F2, у которого отсутствовала флуоресценция, проводили генотипирование на основе ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из взрослых ног, в качестве матриц. Удаление ног не повлияло на выживаемость и плодовитость бабочек.Подробности, касающиеся процедуры скрещивания, показаны на фиг. S1. Вкратце, мы провели обратное скрещивание соматических мутантов F1 с молью WT и использовали ПЦР для идентификации гетерозиготных мутантных животных F2. Отобранные мутанты F2 снова скрещивали с моли дикого типа. Потомки этого скрещивания составляли примерно 50% гетерозигот и 50% животных WT. Затем гетерозиготных по F3 животных скрещивали. Потомство этого скрещивания составляло приблизительно 25% гомозиготных мутантов, 50% гетерозиготных мутантов и 25% животных WT. Затем гомозиготные мутанты F4 скрещивали с сиб-матом для получения 100% гомозиготных животных, которых использовали в последующих экспериментах.

Анализ пищевого поведения личинок

Новоиспеченные личинки пятой стадии голодали в течение 24 часов перед проведением поведенческого анализа. После голодания каждую личинку помещали в стерильную культуральную посуду отдельно. Различные пищевые материалы растительного происхождения, такие как шелковица ( M . alba ), дуб монгольский ( Q . mongolica Fisch. Ex Ledeb.), Яблоко ( M . domestica) , груша ( Pyrus spp.), Соя ( G . max ) и кукурузу ( Z . mays ) помещали в чашки для культивирования. Через 24 ч регистрировали массу личинок и подсчитывали количество помета. Тесты на предпочтение кормления с двумя вариантами выбора были выполнены с использованием листьев растений или искусственных кормов. Листья тутового дерева и дуба монгольского размещали на разных сторонах емкости на расстоянии 2 см от середины. Тест с двумя вариантами кормления с искусственной диетой, содержащей порошок листьев шелковицы, и искусственной диетой, в которой соотношение порошка соевых бобов к порошку кукурузы составляло 1: 1, выполняли, как описано выше.В центр помещали 20 только что вылупившихся личинок пятого возраста после голодания в течение 24 ч или выводок новорожденных личинок. Фотографии были сделаны через 0 и 60 минут после выпуска.

Электрофизиологическая запись

Запись кончика хемосенсиллы, контактирующей с насекомыми, проводилась на медиальной и латеральной шилоконической сенсилле пятого возраста B . mori личинок, как описано ранее с некоторыми модификациями [49, 50]. Головы с первыми грудными сегментами вырезали из только что вылупившихся личинок пятого возраста, которых голодали в течение 24 часов.Серебряную петлю, покрытую AgCl, вставляли в каждую головку до тех пор, пока давление не заставляло ротовые части открываться, а затем петлю соединяли с медным мини-соединителем, который служил регистрирующим электродом. Записывающий стеклянный электрод, заполненный стимулирующим раствором, приводился в контакт с кончиком стилоконической сенсиллы под препаровальным микроскопом. Ответы регистрировались как от медиальной, так и от латеральной шилоконической сенсилл с обеих сторон головы. Стимулы длились 1 с и разделялись интервалом в 3 мин для восстановления и минимизации адаптации.Диаметр кончика стимулирующего электрода составлял приблизительно 50 мкм, что подходит для стимуляции одиночных стилоконических сенсилл. Потенциалы действия (всплески), генерируемые в течение первой секунды после появления стимула, усиливались усилителем (Syntech Taste Probe DTP-1; Hilversum, Нидерланды) и фильтровались (A / D-интерфейс, Syntech IDAC-4; Hilversum, Нидерланды). . Электрофизиологические сигналы регистрировались и анализировались с помощью программы анализа спайков для данных о насекомых (SAPID) Tools, версия 16.0 [51], а также программное обеспечение Autospike версии 3.7 (Syntech, Hilversum, Нидерланды). Растворы сахарозы, мио-инозита, кофеина и салицина, растворенные в 2 мМ KCl, использовали в качестве стимуляторов в электрофизиологических экспериментах. Для каждого стимулятора и соответствующей сенсиллы, реагирующей на стимулятор, тестировали 15 WT и мутантных личинок, которые вылупились от 3 до 5 различных партий выращивания. Раствор 2 мМ KCl служил контролем. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM).

Статистический анализ

Все эксперименты в этом исследовании были выполнены как минимум в трех повторностях. Все данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Различия между группами исследовали либо с помощью двустороннего критерия Стьюдента t , либо с помощью двустороннего дисперсионного анализа. Статистически значимые различия отмечены звездочками.

Дополнительная информация

S1 Рис. Делеции в GR66, вызванные CRISPR / Cas9, и экспериментальная диаграмма для получения гомозиготных мутантных линий.

(A) Геномный мутагенез, индуцированный трансгенной системой CRISPR / Cas9. Различные делеционные мутации TS1 и TS2 были обнаружены у гетерозиготных потомков Nos-Cas9: U6-sgRNA. Цифры в скобках в середине каждой последовательности относятся к межпространственному фрагменту длиной 1403 п.н., который был обнаружен между целевыми сайтами. Последовательность PAM показана красным. (B) Стратегия создания гомозиготного мутанта с использованием трансгенной системы CRISPR / Cas9. (1) Эмбрионы шелкопряда пребластодермы инъецировали трансгенными плазмидами Nos-Cas9 или U6-sgRNA для получения двух линий трансгенных шелкопрядов.(2) Впоследствии две трансгенные линии были гибридизированы с получением животных-основателей (F1), которые экспрессировали sgRNA Cas9 и GR66 . (3) Соматический мутант F1 подвергали обратному скрещиванию с WT для получения потомства F2. Потомство F2, лишенное флуоресценции и событий полной делеции, снова подвергали обратному скрещиванию с моли дикого типа, чтобы получить животных F3, которые были на 50% гетерозиготными и на 50% животными дикого типа. (4) Затем гетерозиготных по F3 животных скрещивали с получением гибридов F4, которые были на 25% гомозиготными мутантами F4, на 50% гетерозиготными мутантами и на 25% животными дикого типа.(5) Гомозиготные мутанты F4 затем скрещивали сибом для получения 100% гомозиготного потомства F5, которое использовали в последующих экспериментах. Были созданы две мутантные линии по аллелю GR66. В приведенной ниже последовательности показано событие мутации. Последовательность PAM показана красным. CRISPR / Cas9, кластеры с регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами / CRISPR-ассоциированная нуклеаза протеина-9; GR66, вкусовой рецептор 66; Nos-Cas9 , pBac [IE1-DsRed2-Nos-Cas9] ; PAM, мотив, прилегающий к протоспейсеру; sgRNA, малая направляющая РНК; U6-sgRNA , pBac [IE1-EGFP-U6-BmGR66-sgRNA] ; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.s001

(TIF)

S2 Рис. Сравнение

GR66 среди WT, ΔGR66-1 и ΔGR66-2 .

(A) Геномная ПЦР GR66 WT, ΔGR66-1 и ΔGR66-2 . ΔGR66-1 имел делецию геномной ДНК длиной 929 п.н., а ΔGR66-2 имел делецию геномной ДНК длиной 931 п.н. в локусе GR66 . (B) ОТ-ПЦР GR66 WT, ΔGR66-1 и ΔGR66-2 . ΔGR66-1 имел делецию 180 п.н., а ΔGR66-2 имел делецию 182 п.н. в ORF. (C) Выравнивание аминокислотной последовательности белка GR66 в WT, ΔGR66-2 и ΔGR66-2 . ΔGR66-1 на 60 а.о. короче, чем белок GR66 дикого типа. ΔGR66-2 на 67 а.о. короче, чем белок GR66 дикого типа. Идентичные аминокислоты обозначены знаком «*». GR66, вкусовой рецептор 66; ORF, открытая рамка считывания; ОТ-ПЦР, обратная транскрипция-ПЦР; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371 / journal.pbio.3000162.s002

(TIF)

S3 Рис. Расширены возможности кормления линии

ΔGR66-1 .

Недавно линяющие личинки пятого возраста ΔGR66-1 после 24 часов голодания съели листья шелковицы (A), дуба монгольского (B), яблони (C), груши (D), сои (E) и кукурузы. (F). (G) ΔGR66-1 , скармливаемый яблоком, грушей, соей и кукурузой, показал значительное увеличение веса по сравнению с диким животным, получавшим те же материалы. Масштабные линейки: 5 мм в A, B, C, D, E и F.(G) ΔGR66-1 , скармливаемый яблоком, грушей, соей и кукурузой, показал значительное увеличение веса по сравнению с диким животным, получавшим те же материалы. Масса тела личинок WT и ΔGR66-1 , скармливаемых на дубе монгольском, не показала увеличения массы через 24 часа кормления. (H) Количество помета (на личинку) от личинок, питавшихся шелковицей, дубом монгольским, яблоком, грушей, соей и кукурузой через 24 часа после начала кормления. Показанные данные были средним значением ± стандартная ошибка среднего ( n = 18 шелкопрядов).Звездочки указывают на значимые различия, рассчитанные с помощью двустороннего теста t : нс (несущественно), *** P <0,001. Базовые данные можно найти в S1 Data. GR66, вкусовой рецептор 66; SEM, стандартная ошибка среднего; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.s003

(TIF)

S5 Рис. Тесты с двумя вариантами выбора с новорожденными личинками.

Новорожденные личинки WT высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев шелковицы и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 через 0 (A) и 1 час (A ’).Новорожденные личинки ΔGR66-1 высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев шелковицы и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 через 0 (B) и 1 час (B ’). Новорожденные личинки ΔGR66-2 высвобождались между искусственной диетой с порошком листьев шелковицы и искусственной диетой с соотношением соевого порошка к кукурузному порошку 1: 1 через 0 (C) и 1 час (C ’). Масштабные линейки: 10 мм в A, A ’, B, B’, C и C ’. Каждый анализ проводили в трех повторностях (технические повторности).GR66, вкусовой рецептор 66; WT, дикий тип.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.s005

(TIF)

S6 Рис. Электрофизиологические реакции на сахарозу и мио-инозитол в латеральных сенсиллах и на кофеин и салицин в медиальных сенсиллах.

(A) Типичные спайковые следы латеральных сенсилл указанных генотипов, стимулированных 2 мМ KCl, 10 мМ сахарозой и 10 мМ мио-инозитолом. ΔGR66-2 мутантных личинок нормально реагировали на сахарозу и инозит.(B) Частоты электрофизиологического ответа латеральных сенсилл указанных генотипов, стимулированных 10 мМ сахарозой и 10 мМ мио-инозитолом. (C) Типичные следы спайков медиальных сенсилл указанных генотипов, стимулированных 2 мМ KCl, 10 мМ кофеином и 10 мМ салицином. ΔGR66-2 мутантных личинок нормально реагировали на сахарозу и инозит. (D) Частоты электрофизиологического ответа медиальных сенсилл указанных генотипов, стимулированных 10 мМ кофеином и 10 мМ салицином.(E) Частоты электрофизиологического ответа медиальных сенсилл указанных генотипов, стимулированных различными концентрациями кофеина. (F) Частоты электрофизиологического ответа медиальных сенсилл указанных генотипов, стимулированных различными концентрациями салицина. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 20 тутовых шелкопрядов). Достоверность оценивалась двусторонним тестом t : нс (не значимо). Базовые данные можно найти в S1 Data. GR66, вкусовой рецептор 66; SEM, стандартная ошибка среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000162.s006

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Сяо-Янь Гао и Цзи-Цинь Ли (Центр передового опыта в области молекулярных наук о растениях, Шанхайский институт физиологии и экологии растений Китайской академии наук) за их помощь в области сканирующей электронной микроскопии.

Ссылки

1. 1. Одзаки М. Регулирование пищевого поведения у мух: действие ядовитого вещества через вкусовые и обонятельные нейроны.Chem Senses. 2005; 30 Приложение 1: i289–90.
2. 2. Fujii S, Yavuz A, Slone J, Jagge C, Song X, Amrein H. Drosophila рецепторы сахара в восприятии сладкого вкуса, обоняния и внутреннего восприятия питательных веществ. Curr Biol. 2015; 25 (5): 621–7. pmid: 25702577
3. 3. ДеДженнаро М., Макбрайд С.С., Зеехольцер Л., Накагава Т., Деннис Э.Дж., Голдман С. и др. Комары-мутанты orco теряют сильное предпочтение у людей и не отталкиваются летучим ДЭТА. Природа. 2013. 498 (7455): 487–91.pmid: 23719379
4. 4. Лиман Э. Р., Чжан Ю. В., Монтелл С. Периферийное кодирование вкуса. Нейрон. 2014. 81 (5): 984–1000. pmid: 24607224
5. 5. Торн Н., Хроми С., Брей С., Амрейн Х. Восприятие вкуса и кодирование у Drosophila . Curr Biol. 2004. 14 (12): 1065–79. pmid: 15202999
6. 6. Гордон, доктор медицины, Скотт К. Контроль моторики во вкусовом контуре Drosophila . Нейрон. 2009. 61 (3): 373–84. pmid: 1

   75

7. 7. Скотт К.Вкусовая обработка в Drosophila melanogaster . Анну Рев Энтомол. 2018; 63: 15–30. pmid: 29324046
8. 8. Watanabe K, Toba G, Koganezawa M, Yamamoto D. Gr39a, очень разнообразный вкусовой рецептор в Drosophila , играет роль в сексуальном поведении. Behav Genet. 2011; 41 (5): 746–53. pmid: 21416142
9. 9. Даханукар А, Лей Ю.Т., Квон Дж.Й., Карлсон-младший. Два гена Gr лежат в основе рецепции сахара у Drosophila . Нейрон. 2007. 56 (3): 503–16.pmid: 17988633
10. 10. Шим Дж., Ли Й., Чон Й. Т., Ким И., Ли М. Г., Монтелл С. и др. Полный набор вкусовых рецепторов Drosophila для обнаружения отвращающего соединения. Nat Commun. 2015; 6: 8867. pmid: 26568264
11. 11. Одзаки К., Рюда М., Ямада А., Утогучи А., Ишимото Х., Калас Д. и др. Вкусовой рецептор, участвующий в распознавании растения-хозяина для откладки яиц бабочки-парусника. Nat Commun. 2011; 2: 542. pmid: 22086342
12. 12.Джонс У.Д., Кайирлиоглу П., Кадоу И.Г., Фоссхалл Л.Б. Два хемосенсорных рецептора вместе опосредуют обнаружение углекислого газа у Drosophila . Природа. 2007. 445 (7123): 86–90. pmid: 17167414
13. 13. Xiang Y, Yuan Q, Vogt N, Looger LL, Jan LY, Jan YN. Фоторецепторы, опосредующие избегание света, покрывают стенку тела личинки Drosophila . Природа. 2010. 468 (7326): 921–6. pmid: 21068723
14. 14. Ni L, Bronk P, Chang EC, Lowell AM, Flam JO, Panzano VC и др.Паралог вкусовых рецепторов контролирует быстрое избегание тепла у Drosophila . Природа. 2013; 500 (7464): 580–4. pmid: 232
15. 15. Робертсон Х.М., Ваннер К.В. Суперсемейство хеморецепторов медоносной пчелы, Apis mellifera : расширение семейства пахучих, но не вкусовых рецепторов. Genome Res. 2006. 16 (11): 1395–403. pmid: 17065611
16. 16. Робертсон Х.М., Уорр К.Г., Карлсон-младший. Молекулярная эволюция суперсемейства гена хеморецепторов насекомых в Drosophila melanogaster .Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 Suppl 2: 14537–42.
17. 17. Hill CA, Fox AN, Pitts RJ, Kent LB, Tan PL, Chrystal MA и др. G-белковые рецепторы в Anopheles gambiae . Наука. 2002. 298 (5591): 176–8. pmid: 12364795
18. 18. Кент Л.Б., Уолден К.К., Робертсон Х.М. Семейство Gr кандидатных вкусовых и обонятельных рецепторов у комара желтой лихорадки Aedes aegypti . Chem Senses. 2008. 33 (1): 79–93. pmid: 17928357
19. 19.Tribolium Genome Sequencing C, Richards S, Gibbs RA, Weinstock GM, Brown SJ, Denell R, et al. Геном модельного жука и вредителя Tribolium castaneum . Природа. 2008. 452 (7190): 949–55. pmid: 18362917
20. 20. Маккенна Д.Д., Скалли Э.Д., Поше Й., Гувер К., Кирш Р., Гейб С.М. и др. Геном азиатского усачка ( Anoplophora glabripennis ), глобально значимого инвазивного вида, обнаруживает ключевые функциональные и эволюционные инновации на стыке жуков и растений.Genome Biol. 2016; 17 (1): 227. pmid: 27832824
21. 21. Ю М, Юэ З, Хэ Ш, Ян X, Ян Г, Се М и др. Гетерозиготный геном моли дает представление о травоядности и детоксикации. Нат Жене. 2013. 45 (2): 220–5. pmid: 23313953
22. 22. Кениг С., Хирш А., Бакс С., Клиннер С., Фогель Н., Шукла А. и др. Эталонный набор генов для генов хемосенсорных рецепторов Manduca sexta. Насекомое Biochem Mol Biol. 2015; 66: 51–63. pmid: 26365739
23. 23. Жан С., Мерлин С., Буре Дж. Л., Репперт С. М..Геном бабочки-монарха дает представление о миграции на большие расстояния. Клетка. 2011. 147 (5): 1171–85. pmid: 22118469
24. 24. Геном Heliconius C. Геном бабочки обнаруживает беспорядочный обмен мимикрическими адаптациями между видами. Природа. 2012. 487 (7405): 94–8. pmid: 22722851
25. 25. Асаока К. Дефицит вкусовой чувствительности к некоторым отпугивающим соединениям у «многоядных» мутантных штаммов тутового шелкопряда, Bombyx mori . J. Comp Physiol A. 2000; 186 (11): 1011–8.pmid: 11195277
26. 26. Иизука Т., Тамура Т., Сезуцу Х., Мазе К., Окада Э., Асаока К. Генетический анализ электрофизиологического ответа на горькое вещество салицин у многоядного штамма тутового шелкопряда Bombyx mori . PLoS ONE. 2012; 7 (5): e37549. pmid: 22649537
27. 27. Mase K, Iizuka T, Yamamoto T., Okada E, Hara W. Генетическое картирование гена пищевых предпочтений шелкопряда, Bombyx mori , с использованием полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов (RFLP).Genes Genet Syst. 2007. 82 (3): 249–56. pmid: 17660695
28. 28. Го Х, Ченг Т., Чен З, Цзян Л., Го И, Лю Дж и др. Карта экспрессии полного набора генов вкусовых рецепторов в хемосенсорных органах Bombyx mori . Насекомое Biochem Mol Biol. 2017; 82: 74–82. pmid: 28185941
29. 29. Сато К., Танака К., Тухара К. Регулируемый сахаром катионный канал, образованный вкусовыми рецепторами насекомых. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011; 108 (28): 11680–5. pmid: 21709218
30. 30.Zhang HJ, Anderson AR, Trowell SC, Luo AR, Xiang ZH, Xia QY. Топологическая и функциональная характеристика вкусовых рецепторов насекомых. PLoS ONE. 2011; 6 (8): e24111. pmid: 21
31. 8
32. 31. Кикута С., Эндо Х, Томита Н., Такада Т., Морита С., Асаока К. и др. Характеристика катионного канала, управляемого лигандом, на основе рецептора инозита в silkwo rm , Bombyx mori . Насекомое Biochem Mol Biol. 2016; 74: 12–20. pmid: 27132146
33. 32. Terenius O, Papanicolaou A, Garbutt JS, Eleftherianos I, Huvenne H, Kanginakudru S и др.РНК-интерференция в Lepidoptera: обзор успешных и неудачных исследований и значение для экспериментального дизайна. J. Insect Physiol. 2011; 57 (2): 231–45. pmid: 21078327
34. 33. Бибикова М., Голич М., Голич К.Г., Кэрролл Д. Целевое хромосомное расщепление и мутагенез у Drosophila с использованием нуклеаз цинкового пальца. Генетика. 2002. 161 (3): 1169–75. pmid: 12136019
35. 34. Кэрролл Д. Геномная инженерия с целевыми нуклеазами. Анну Рев Биохим.2014; 83: 409–39. pmid: 24606144
36. 35. Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии. Клетка. 2014. 157 (6): 1262–78. pmid: 246
37. 36. Ван И, Ли З, Сюй Дж, Цзэн Б., Линг Л., Ю Л. и др. Система CRISPR / Cas обеспечивает эффективную инженерию генома в Bombyx mori . Cell Res. 2013. 23 (12): 1414–6. pmid: 24165890
38. 37. Xu J, Chen S, Zeng B, James AA, Tan A, Huang Y. Соматический ингибитор Р-элемента Bombyx mori (BmPSI) является ключевым вспомогательным фактором для определения пола самца тутового шелкопряда.PLoS Genet. 2017; 13 (1): e1006576. pmid: 28103247
39. 38. Zhang Z, Liu X, Shiotsuki T, Wang Z, Xu X, Huang Y и др. Истощение эстеразы ювенильного гормона увеличивает рост личинок у Bombyx mori . Насекомое Biochem Mol Biol. 2017; 81: 72–9. pmid: 28057597
40. 39. Zhu GH, Xu J, Cui Z, Dong XT, Ye ZF, Niu DJ и др. Функциональная характеристика SlitPBP3 в Spodoptera litura посредством редактирования генома, опосредованного CRISPR / Cas9. Насекомое Biochem Mol Biol.2016; 75: 1–9. pmid: 271
41. 40. Хуанг И, Чен И, Цзэн Б., Ван И, Джеймс А.А., Гурр Г.М. и др. CRISPR / Cas9 опосредовал нокаут гомеотического гена abdominal-A у глобального вредителя, моли ромбовидной ( Plutella xylostella ). Насекомое Biochem Mol Biol. 2016; 75: 98–106. pmid: 27318252
42. 41. Ван Дж, Чжан Х, Ван Х, Чжао С., Цзо И, Ян И и др. Функциональная проверка кадгерина как рецептора токсина Bt Cry1Ac в Helicoverpa armigera с использованием системы CRISPR / Cas9.Насекомое Biochem Mol Biol. 2016; 76: 11–7. pmid: 27343383
43. 42. Apostolopoulou AA, Rist A, Thum AS. Вкусовая обработка личинок дрозофилы. Front Integr Neurosci. 2015; 9:50. pmid: 26528147
44. 43. Лю Ц., Лю В., Цзэн Б., Ван Г, Хао Д., Хуанг Ю. Делеция корецептора пахучего рецептора Bombyx mori (BmOrco) ухудшает обонятельную чувствительность тутовых шелкопрядов. Насекомое Biochem Mol Biol. 2017; 86: 58–67. pmid: 28577927
45. 44. Джозеф RM, Sun JS, Tam E, Carlson JR.Рецептор и нейрон, которые активируют цепь, ограничивающую потребление сахарозы. Элиф. 2017; 6.
46. 45. Ху И, Хань И, Шао И, Ван Х, Ма И, Лин Э и др. Gr33a модулирует предпочтение ухаживания самцов дрозофилы . Научный доклад 2015; 5: 7777. pmid: 25586066
47. 46. Танака К., Уда Й, Оно Й, Накагава Т., Сува М., Ямаока Р. и др. Высокоселективная настройка обонятельных рецепторов тутового шелкопряда на ключевые летучие вещества тутового дерева. Curr Biol. 2009. 19 (11): 881–90. pmid: 19427209
48. 47.Чапман РФ. Контактная хеморецепция при питании насекомыми-фитофагами. Анну Рев Энтомол. 2003. 48: 455–84. pmid: 12414737
49. 48. Тан А., Фу Г, Джин Л., Го Ц., Ли З, Ню Б. и др. Основанная на трансгенах, специфическая для самок система летальности для генетического определения пола тутового шелкопряда, Bombyx mori . Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110 (17): 6766–70. pmid: 23569267
50. 49. Ходжсон Э.С., Леттвин Дж.Й., Родер К.Д. Физиология первичного хеморецепторного блока. Наука.1955. 122 (3166): 417–8. pmid: 13246649
51. 50. Loon JJAV. Хеморецепция фенольных кислот и флавоноидов у личинок двух видов Pieris. J. Comp Physiol A. 1990; 166 (6): 889–99.
52. 51. Смит Дж. Б., Митчелл Б. К., Ролсет Б. М., Уайтхед А. Т., Альберт П. Дж. Инструменты SAPID: микрокомпьютерные программы для анализа записей нескольких единиц нервов. Химические чувства. 1990. 15 (3): 253–70.

Местный муравей, Tapinoma melanocephalum, улучшает выживаемость инвазивного мучнистого червеца Phenacoccus solenopsis, защищая его от паразитоидов

Loeschcke, V.И Кристиансен, Ф. Б. [Эволюция и мутуализм] Популяционная биология [Вёрманн, К. и Джейн С. К. (ред.)] [395–402] (Springer Berlin Heidelberg, 1990).

Аксен, А. Х., Леймар, О. и Хоффман, В. Сигнализация в мутуалистическом взаимодействии. Anim Behav 52, 321–333 (1996).

Артикул Google Scholar

Мондор, Э. Б. и Аддикотт, Дж. Ф. Способствуют ли эксаптации мутуалистическим ассоциациям между инвазивными и местными видами? Biol Invasions 9, 623–628 (2007).

Артикул Google Scholar

Стивен У. П. [Взаимоотношения во взаимодействиях растений и насекомых] Энциклопедия растений и растениеводства [Гудман, Р. М. (ред.) [763–766] (Тейлор и Фрэнсис, Нью-Йорк, 2007).

Уэй, М. Дж. Взаимоотношения между муравьями и производящими падь Homoptera. Энн Рев Энтомол 8, 307–344 (1963).

Артикул Google Scholar

Бакли Р.C. Взаимодействие с растениями, Homoptera и муравьями. Ann Rev Ecol System 18, 111–135 (1987).

Артикул Google Scholar

Хелмс, К. Р. и Винсон, С. Б. Широко распространенная ассоциация инвазивного муравья Solenopsis invicta с инвазивным мучнистым червецом. Экология 83, 2425–2438 (2002).

Артикул Google Scholar

Холуэй, Д. А., Лач, Л., Суарес, А.В., Цуцуи, Н. Д. и Кейс, Т. Дж. Причины и последствия нашествий муравьев. Ann Rev Ecol System 33, 181–233 (2002).

Артикул Google Scholar

Kishimoto-Yamada, K., Itioka, T. и Kawai, S. Биологическая характеристика облигатного симбиоза между Acropyga sauteri Forel (Hymenoptera: Formicidae) и Eumyrmococcus smithii Silvestocteraecteraecidae: на острове Окинава, юг Японии.J Nat Hist 39, 3501–3524 (2005).

Артикул Google Scholar

Филлипс И. Д. и Уиллис К. К. Защитное поведение муравьев в мутуалистических отношениях с тлей. Behav Ecol Sociobiol 59, 321–325 (2005).

Артикул Google Scholar

Стадлер Б. и Диксон А. Ф. Г. Экология и эволюция взаимодействий тлей и муравьев. : Annu Rev Ecol Evol Syst 36, 345–372 (2005).

Артикул Google Scholar

Брайтвелл, Р. Дж. И Сильверман, Дж. Инвазивные аргентинские муравьи снижают приспособленность красного клена за счет мутуализма с эндемичной кокцидой. Biol Invasions 12, 2051–2057 (2010).

Артикул Google Scholar

Штутц, С. и Энтлинг, М. Х. Влияние ландшафтного контекста на взаимодействие тлей, муравьев и хищников на вишневых деревьях. Biol Control 57, 37–43 (2011).

Артикул Google Scholar

Чжоу, А., Лу, Ю., Цзэн, Л., Сюй, Ю. и Лян, Г. Является ли мутуализм движущей силой вторжения двух чужеродных видов? Случай Solenopsis invicta и Phenacoccus solenopsis . PLoS ONE 7, e41856 (2012).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Надь, К., Кросс, Дж. В. и Марко, В. Сахарное кормление обыкновенного черного муравья, Lasius niger (L.), как возможный косвенный метод сокращения популяций тли на яблонях путем нарушения мутуализма муравьев. Biol Control 65, 24–36 (2013).

CAS Статья Google Scholar

Carabalí-Banguero, DJ, Wyckhuys, KAG, Montoya-Lerma, J., Kondo, T. & Lundgren, JG Влияют ли дополнительные источники сахара на степень посещаемости Dysmicoccus brevipes огненным муравьем Solenopsis geminata ? Entomol Exp Appl 148, 65–73 (2013).

Артикул Google Scholar

Hölldobler, B. & Wilson, E.O. Муравьи. (Издательство Belknap Press of Harvard University Press, Кембридж (Массачусетс), 1990).

Vantaux, A., Van den Ende, W., Billen, J. & Wenseleers, T. Значительные межклоновые различия в секреции мелецитозы у тлей черной фасоли, подвергающейся необязательному уходу с муравьями Aphis faba e. J. Insect Physiol 57, 1614–1621 (2011).

CAS Статья Google Scholar

Сандерс, Д.И Ван Вин, Ф. Дж. Ф. Влияние мутуализма муравьев и тлей на функциональный состав вторичного паразитоидного сообщества. Ecol Entomol 35, 704–710 (2010).

Артикул Google Scholar

Тинсли, Дж. Кокцида муравьиного гнезда из Нью-Мексико. Может Энтомол 30, 47–48 (1898).

Артикул Google Scholar

Уильямс, Д. Дж. И Гранара де Виллинк, М.C. Мучнистые червецы Центральной и Южной Америки. (CAB International, Лондон, Англия, 1992).

Кумар, Р., Награре, В. С., Нитарвал, М., Свами, Д. и Прасад, Ю. Г. Распространение инвазивного мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis и связанные с ним потери хлопка. Phytoparasitica 42, 311–316 (2013).

Артикул Google Scholar

Prabhakar, M. et al. Гиперспектральные индексы для оценки повреждения мучнистым червецом соленопсисом (Hemiptera: seudococcidae) хлопка.Comput Electron Agr 97, 61–70 (2013).

Артикул Google Scholar

Fand, BB, Tonnang, HEZ, Kumar, M., Kamble, AL & Bal, SK Фенологическая модель на основе температуры для прогнозирования развития, выживаемости и потенциала роста популяции мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis Tinsley (Hemiptera : Pseudococcidae). Crop Prot 55, 98–108 (2014).

Артикул Google Scholar

Карар, Х. Phenacoccus solenopsis Tinsley (Sternorrhyncha: Coccoidea: Pseudococcidae), инвазивный мучнистый червец, повреждающий хлопок в Пакистане и Индии, с обсуждением сезонных морфологических изменений. Zootaxa 1, 1913 (2008).

Google Scholar

Ву, С. и Чжан, Р. Новый инвазивный вредитель, Phenacoccus solenopsis , серьезно угрожающий производству хлопка. Чин Бык-энтомол 46, 159–162 (2009).

Google Scholar

Ван, Ю.П., Уотсон, Г. В. и Чжан, Р. Возможное распространение инвазивного мучнистого червеца Phenacoccus solenopsis и его угроза хлопку в Азии. Сельское хозяйство для энтомола 12, 403–416 (2010).

Артикул Google Scholar

Hayat, M. Описание нового вида Aenasius Walker (Hymenoptera: Eneyrtidae), паразитоида мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis Tinsley в Индии. Biosystematica 3, 21–26 (2009).

Google Scholar

Ashfaq, M., Shah, GS, Noor, AR, Ansari, SP и Mansoor, S. Сообщение о паразитической осе (Hymenoptera: Encyrtidae), паразитирующей на хлопчатобумажном мучнистом червеце (Hemiptera: Pseudococcidae) в Пакистане, и использовании ПЦР для оценка уровня паразитизма. Biocontrol Sci Tech 20, 625–630 (2010).

Артикул Google Scholar

Бабасахеб, Б., Гаутам, Ф.Р. Д. и Суроше, С. С. Пригодность различных стадий мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis (Homoptera: Pseudococcidae) для развития и выживания одиночного эндопаразитоида, Aenasius bambawalei (Hymenoptera: Encyrtidae). Biocontrol Sci Tech 21, 51–55 (2011).

Артикул Google Scholar

Chen, H. Y., Liu, J. X. & Xu, Z. F. Описание нового паразитоида платигастрид Allotropa phenacocca (Hymenoptera) на Phenacoccus solenopsis Tinsley (Hemiptera: Pseudococcidae).Восточные насекомые 45, 275–280 (2011).

CAS Статья Google Scholar

He, L. F., Feng, D. D., Li, P. & Xu, Z. F. Выбор Aenasius bambawalei Hayat (Hymenoptera: Encyrtidae) для мучнистого червеца Phenacoccus solenopsis Tinsley (Hemociptera: Hemociptera). J. Environ Entomol. 34, 329–333 (2012).

Google Scholar

Manickavasagam, S.И Рамешкумар А. Описание двух новых видов перепончатокрылых паразитоидов из Индии. Восточные насекомые 46, 182–189 (2012).

Артикул Google Scholar

Кумар Р., Кранти К. и Монга Д. Естественное паразитирование Phenacoccus solenopsis Tinsley (Hemiptera: Pseudococcidae) на хлопке, вызванное Aenasius bambawalei Hayat (Hymenopdae): Encyrtirtirti. J Biol Control 23, 457–461 (2009).

Google Scholar

Ram, P., Шайни, Р. К. и Виджая. Предварительные исследования полевого паразитирования и биологии паразитоида соленопсиса мучнистого червеца, Aenasius bambawalei Hayat (Encyrtidae: Hymenoptera). J Cotton Res Devel 23, 313–315 (2009).

Google Scholar

Chen, H.Y., Cao, R.X. & Xu, Z.F. Первое упоминание о Aenasius bambawalei Hayat (Hymenoptera: Encyrtidae), паразитоиде мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis mocipocinsley из China. J Environ Entomol 32, 280–282 (2010).

Google Scholar

Рам, П. и Сайни, Р. К. Биологический контроль мучнистого червеца соленопсиса, Phenacoccus solenopsis Тинсли на хлопке: типичный пример случайного биологического контроля. J Biol Control 24, 104–109 (2010).

Google Scholar

Дхаван, А. К., Сингх. К. и Сайни, С.Паразитирующий потенциал паразитоида ( Aenasius bambawalei ) на мучнистом червеце ( Phenacoccus solenopsis ) хлопчатника ( Gossypium spp.) И сорных растений. Индийский журнал J Agr Sci 80, 97–99 (2011).

Google Scholar

Танвар Р. К., Джеякумар П. и Сингх А. Исследование хлопкового мучнистого червеца, Phenacoccus solenopsis (Tinsley) и его естественных врагов. J. Environ Biol. 32, 381–384 (2011).

CAS PubMed Google Scholar

Чжоу, А., Zeng, L., Lu, Y., Xu, Y. & Liang, G. Огненные муравьи защищают мучнистых червецов от их естественных врагов, используя укрытия для листьев, построенные валиком для листьев Sylepta derogat a. PLoS ONE 7, e49982 (2012).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Фенг Д. Д. Фундаментальные исследования по использованию Aenasius bambawalei Hayat. Магистерская работа Южно-Китайского сельскохозяйственного университета (2013 г.).

Эбботт, К.Л., Гривз, С. Н. Дж., Ричи, П. А. и Лестер, П. Дж. Поведенческие и генетически отличные популяции инвазивных муравьев дают представление об истории вторжений и воздействиях на сообщество тропических муравьев. Biol Invasions 9, 453–463 (2007).

Артикул Google Scholar

Бэнкс, К. Дж. Воздействие муравья Lasius niger (L.) на насекомых, охотящихся на небольшие популяции Aphis fabae Scop на бобовых растениях.Ann ApplBiol 50, 669–679 (1962).

Google Scholar

Диксон А.Ф. и Агарвала Б.К. Изменения жизненного цикла тлей, вызванные божьей коровкой. P Roy Soc B-Biol Sci 266, 1549–1553 (1999).

Артикул Google Scholar

Яо, И., Шибао, Х. и Акимато, С. Затраты и преимущества ухода за муравьями дрепаносифидной тли Tuberculatus quercicola .Ойкос 89, 3–10 (2000).

Артикул Google Scholar

Majerus, M. E. N., Sloggett, J. J., Godeau, J. F. & Hemptinne, J. L. Взаимодействие между муравьями и божьими коровками-афидофагами и кокцидофагами. Popul Ecol 49, 15–27 (2007).

Артикул Google Scholar

Пирс, Н. Э. и Мид, П. С. Паразитоиды как селективные агенты в симбиозе между муравьями и личинками ликаенид.Science 211, 1185–1187 (1981).

CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Пирс, Н. Э. и Истил, С. Селективное преимущество ухода за муравьями для личинок ликаенидной бабочки Glaucopsyche lygdamus. J Anim Ecol 55, 451–462 (1986).

Артикул Google Scholar

Леймар, О. и Аксен, А. Х. Стратегическое поведение в межвидовом мутуализме: взаимодействия между личинками ликаенид и муравьями.Anim Behav 46, 1177–1182 (1993).

Артикул Google Scholar

Кедар, С. К., Сайни, Р. К. и Рам, П. Вмешательство муравьев в эффективность паразитирования Aenasius bambawalei Hayat против Phenacoccus solenopsis Tinsley. Биоинфолет 10, 362–362 (2013).

Google Scholar

Суарес, А.В., Цуцуи, Н.Д., Холуэй, Д.А.И Кейс, Т. Дж. Поведенческие и генетические различия между аборигенными и интродуцированными популяциями аргентинских муравьев. Биол Вторжения 1, 43–53 (1999).

Артикул Google Scholar

Границы | Dl-3-n-бутилфталид облегчает демиелинизацию и улучшает когнитивные функции, способствуя митохондриальной динамике в поражениях белого вещества

Введение

Поражения белого вещества (WML) являются одними из основных факторов, которые приводят к снижению когнитивных функций и сосудистой деменции (VaD), особенно среди пожилых людей (Alber et al., 2019). WML обычно вызывается умеренным, но хроническим снижением кровотока, сопровождающимся недостатком подачи кислорода через мелкие сосуды (Ben-Ari et al., 2019). Демиелинизация — это характеристика патологических изменений в WML, которая приводит к худшим клиническим исходам и нарушению когнитивных функций у пациентов (Datta et al., 2017). Поэтому крайне необходимо выяснить, как уменьшить повреждение демиелинизации и уменьшить нарушение функции мозга.

В 2002 году FDA Китая одобрило использование Dl-3-n-бутилфталида (Dl-NBP), соединения, экстрагированного из семян сельдерея, для лечения ишемического инсульта (Wang et al., 2018; Чен и др., 2019; Ян и др., 2019). Кроме того, в США проходит фаза II исследования лечения ишемического инсульта (Cui et al., 2013; Xue et al., 2016). Ранее больше внимания уделялось острой фазе инсульта, а нейропротекторные эффекты Dl-NBP при инсульте широко подтверждаются как клиническими, так и фундаментальными исследованиями (Chen et al., 2020). Механически исследования показали, что D1-NBP может ингибировать апоптоз нейронов, стресс эндоплазматического ретикулума и окислительный стресс, а также улучшать гемодинамику, а также нейрогенез (Sun et al., 2017; Wang et al., 2018, 2019). Однако, как многообещающее молекулярное соединение при лечении ишемических повреждений головного мозга, функция D1-NBP при WML и демиелинизации не ясна и не подтверждена.

Из ограниченных исследований WML данные показывают, что Dl-NBP может способствовать когнитивной функции в моделях VaD, вызванной хронической гипоперфузией (Li et al., 2019). Нормальная когнитивная функция требует относительно нормального электронного сигнала и синаптического сигнала, которые зависят от интактного миелина, а также холинергической нейротрансмиссии (Feng et al., 2020b). Благоприятные эффекты Dl-NBP на VaD были продемонстрированы улучшением ремиелинизации и усилением функции холинергической системы (Tian et al., 2020). Тем не менее, ремиелинизация происходит на поздней стадии повреждения WML, и функция холинергической системы тесно связана с электронным сигналом от аксонов (Lema et al., 2017). Еще предстоит определить, может ли D1-NBP улучшить электронную функцию синапса или облегчить распад миелина на ранней стадии.

В условиях гипоперфузии митохондрии являются наиболее чувствительными организмами в нейронах, которые обнаруживают ишемию / гипоксию и быстро изменяют свою динамику и метаболизм (Bargiela et al., 2018). Аксоны страдают ишемическим повреждением и демонстрируют аномальную митохондриальную динамику, показывая нарушенный транспорт деления-слияния в аксонах (Chen et al., 2018; Thomas and Ashcroft, 2019). Сниженный ретроградный транспорт дисфункциональных митохондрий может блокировать митофагию и вызывать неблагоприятные реактивные формы кислорода (АФК), которые вредны для миелина (Palikaras et al., 2015). Антероградность митохондрий жизненно важна для снабжения синапсом энергией для высвобождения нейромедиаторов (Zheng et al., 2019).Таким образом, мы предположили, что Dl-NBP может повторно излечивать демиелинизацию в WML, регулируя митохондриальную динамику. В настоящем исследовании мы исследовали влияние Dl-NBP на митохондриальную динамику и демиелинизацию с использованием модели WML.

Материалы и методы

Животные

Самцов мышей C57BL / 6J (9–12 недель, 25–30 г) были приобретены в Charles River Laboratories и размещены в Центре экспериментальных животных при Университете Фудань, Шанхай, Китай, в помещении с контролируемой температурой и влажностью, свободном от специфических патогенов. лаборатория с 12/12 часовым циклом свет / темнота.Все процедуры выполнялись в соответствии с Руководством для Национального научного совета Китайской Народной Республики, а исследование было одобрено Комитетом по этике Университета Фудань (номер одобрения IRB 201A259). Эта рукопись была написана в соответствии с Руководством по исследованиям на животных: отчет о экспериментах in vivo (ARRIVE).

Модель BCAS и лечение DI-NBP

Модель двустороннего стеноза сонной артерии (BCAS) была выполнена, как описано ранее (Feng et al., 2020b). Вкратце, мышей анестезировали с использованием 4% изофлурана в 28% O ₂ и 68% N ₂ и поддерживали на 2% изофлуране в 29% O ₂ и 69% N ₂ с помощью маски. После выполнения среднего кожного разреза на шее, двусторонние общие сонные артерии были изолированы и затем стенозированы с помощью стальных микрокатушек толщиной 0,18 мм (Wuxi Samini / Sawane Spring Co., Ltd., город Хамамацу, Япония). Для мышей, подвергшихся ложной операции, применялась аналогичная процедура, в то время как микрокатушки не использовались для индукции BCAS.Для лечения D1-NBP: лечение низкими дозами DI-NBP (L-NBP, 50 мг / кг / день) и лечение высокими дозами D1-NBP (H-NBP, 100 мг / кг / день) вводили внутрижелудочно через 1 день после операции BCAS в течение 28 дней.

Все экспериментальные группы были рандомизированы, и все анализы результатов проводились независимыми исследователями, не знавшими условий лечения и типов мышей. Рандомизация каждой экспериментальной группы проводилась перед хирургической процедурой с использованием генератора случайных чисел в GraphPad.Предварительные данные TEM и экспериментов с восьмилучевым лабиринтом показали, что 6 и 12 животных в группе, соответственно, будет достаточно для получения 80% мощности при уровне значимости <0,05 с помощью двустороннего теста.

Культура срезов мозжечка и лечение D1-NBP

Для культивирования органотипических срезов мозжечка использовали мышей 8-9 дней после рождения (P8-9). Около 400 мкм парасагиттальных срезов мозжечка мышей P8-9 получали с использованием вибратома (ZQP-86, Zhixin Co., Ltd., Шанхай, Китай). Срезы помещали во вкладыши для клеточных культур (Millipore, Bedford, MA, USA) и культивировали в 50% модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 25% сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS), 25% лошадиной сывороткой и 5 мг. / мл глюкозы (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в камерах для культивирования клеток при 37 ° C.

Обработку с низким содержанием глюкозы и низким содержанием кислорода (LGLO) (2% O ₂ и 1 мг / мл глюкозы) использовали для создания условий хронической гипоперфузии для срезов в течение 48 часов. D1-NBP в дозе 50 мкм добавляли к культивируемым срезам перед обработкой LGLO, что является относительно высокой дозой, которая постоянно использовалась в предыдущих исследованиях (Li et al., 2019). Эксперименты и анализ данных проводились двойным слепым методом.

Сверхэкспрессия синтафилина

Сверхэкспрессия (OE) плазмиды синтафилина (SNPH) и аденоассоциированного вируса (AAV) 2/9 или лентивируса была сконструирована Genomeditech (Genomeditech, Шанхай, Китай). Для культивирования срезов мозжечка лентивирус добавляли в среду среза в количестве 1 ^* 10 ¹⁰ копий гена за 5 дней до обработки LGLO.

Для мышей плазмиду AAV 2/9 SNPH-OE или пустой вектор AAV стереоскопически вводили в боковые желудочки.Мышей анестезировали с использованием 4% изофлурана в 30% O ₂ и 70% N ₂ и поддерживали на 2% изофлуране в 30% O ₂ и 70% N ₂ с помощью маски. Векторы AAV вводили в левый боковой желудочек (координаты от bregma: AP, -0,2 мм; ML, +1,0 мм; DV, -2,3 мм). Копии генома размером 5 × 10 ¹¹ инфузировали со скоростью 1 мкл / мин. После инъекции иглу оставляли на 2 мин, чтобы предотвратить обратный ток перед удалением.

Интервальная визуализация с использованием конфокальной микроскопии

Как описано ранее (Lin et al., 2017) митохондрии метили MitoTracker Red CMXRos, M7512 (Thermofisher Scientific, США) в течение 3 ч после обработки срезов мозга LGLO. После тщательной промывки срезы помещали в инкубатор с воздушным потоком при 37 ° C и отображали с помощью инвертированного конфокального микроскопа Olympus с иммерсионным масляным объективом 60 × 1,3 NA с разрешением 512 × 512 пикселей (FV1200, Olympus).

После получения изображений для каждого эксперимента были получены изображения в течение 5 минут с интервалами 15 с. Общее время визуализации в реальном времени было ограничено до 20 минут, чтобы минимизировать фототоксическое повреждение.Длину, площадь и диаметр митохондрий аксонов измеряли с помощью программы ImageJ (NIH, США). Количество и средняя скорость подвижных митохондрий анализировали с помощью кимографов. Стационарные участки в этом исследовании были определены как CMXRos-положительные профили, которые были стационарными в течение 5-минутного периода. Для измерения размера неподвижных митохондрий была получена пара стопок изображений, включающая все CMXRos-положительные профили каждого аксона в периоды времени 0 и 5 мин.

Иммунофлуоресценция

Срезы мозга фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA), а затем в 30% сахарозе в течение 2 дней при 4 ° C.Затем срезы блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 1 часа и повышали проницаемость с помощью 0,1% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 15 минут. Первичные антитела, разведенные в блокирующем буфере, добавляли к срезам и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Первичные антитела, использованные в этом эксперименте, были анти-NF (1:50, ab8135, Abcam, США) и антимальтозосвязывающим белком (MBP) (1: 200, ab40390, Abcam, США). Срезы трижды промывали PBS и метили вторичным антителом, конъюгированным с флуоресценцией, в течение 1 ч при комнатной температуре (Alexa Fluor 488 и 594, 1: 1000, Life Technologies).Ядра визуализировали путем монтажа с помощью DAPI (28718-90-3; Sigma Aldrich, США).

Для окрашивания ROS в митохондриях использовали индикатор митохондриального супероксида MitoSOX ™ Red (M36008, ThermoFisher, США) для маркировки ROS в митохондриях. MitoSOX разводили в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали со срезами в течение 3 часов. После обширной промывки PBS срезы были заполнены указанной культуральной средой.

Вестерн-блот

Срезы мозга собирали и лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) [50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), 0,5% дезоксихолат] с ингибитором протеазы. Равные количества белков, измеренные методом BCA, загружали на 15% Bris-Tris NuPAGE, подвергали электрофорезу и переносили на нитроцеллюлозные мембраны 0,22 мкм. После блокирования 5% BSA в TBST в течение 1 ч мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C со следующими первичными антителами: анти-SNPH (ab69992, Abcam, США), анти-Miro1 (ab188029, Abcam, США), анти-SNPH (ab69992, Abcam, США), анти-Miro1 (ab188029, Abcam, США), -Trak1 (ab28751, Abcam, США), анти-HSP60 (ab1_{, Abcam, США) и анти-β-актин (ab115777, Abcam, США) в разведении 1: 1000 (забуференный трис физиологический раствор с 0.1% моющего средства Tween ^® 20).}

Просвечивающий электронный микроскоп

ТЕМ был выполнен, как описано ранее (Guo et al., 2019). Короче говоря, образцы мозга перфузировали PBS и 4% параформальдегидом (PFA). Иссеченные ткани (толщиной 1 мм) предварительно фиксировали в забуференном OsO ₄ , обезвоживали в растворах градации спирта и пропилена, заливали в Epon и исследовали с помощью световой микроскопии после окрашивания толуидиновым синим. Тонкие срезы, вырезанные с использованием покрытых формваром щелевых решеток и окрашенные уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали с помощью электронного микроскопа JEOL 1200.G-отношения определяли как отношение внутренней и внешней окружности аксонов с помощью программы ImageJ.

Тест восьмилучевого радиального лабиринта

Тест радиального лабиринта с восемью рукавами был выполнен, как описано ранее (Xu et al., 2019). Лабиринт представлял собой центральную платформу (диаметром 24 см) с восемью рукавами, вытянутыми в радиальном направлении. Мыши позволяли посещать каждую руку, чтобы съесть восемь гранул в кормушках, помещенных рядом с концом каждой руки. Каждое подопытное животное раз в день обучалось запоминать устройство.Работоспособность подопытных животных в каждом испытании оценивали с использованием двух параметров, а именно количества правильных выборов в начальных восьми выбранных группах и количества ошибок (определяемых как выбор рук, которые уже были посещены). Когда подопытные животные сделали семь или восемь правильных выборов с не более чем одной ошибкой в ​​трех последовательных сеансах, считалось, что они запомнили лабиринт.

Электрофизиология цельноклеточных патч-зажимов

Как описано ранее (Feng et al., 2020a), культивированные срезы головного мозга переносили в раствор патч-кламп на 1 ч перед записью. Раствор ванны содержал 126 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 26 мм NaHCO ₃ , 1,25 мм Na _{H 2 PO 4} , 2 мм CaCl ₂ , 2 мм MgCl ₂ и 11 мм глюкоза барботировалась 95% O ₂ + 5% CO ₂ . Температура раствора бани поддерживалась на уровне 32 ° C. Для регистрации миниатюрного возбуждающего постсинаптического тока (mEPSC) патч-пипетки, содержащие 126 мм K-глюконат, 4 мм KCl, 4 мм ATP-Mg, 0.Использовали 3 мМ GTP- Na ₂ , 10 мМ креатин PO, 10 мМ HEPES и 0,2–0,5% биоцитин (pH 7,3, установленный с помощью КОН, 300 мОсм, поддерживаемый с помощью сахарозы) с сопротивлением кончика 6-8 МОм. . Во время записи mEPSC вводили тетродотоксин (TTX) (0,5 мкм), чтобы заглушить сетевую активность за счет ингибирования чувствительных к напряжению натриевых каналов, и бикукуллин (10 мкм), чтобы блокировать GABA-A-опосредованную ингибирующую передачу сигналов.

Для регистрации потенциалов действия (AP) патч-пипетки, содержащие 140 мМ K-глюконат, 5 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) (EGTA), 0.5 мМ CaCl ₂ , 2 мМ ATP-Mg, 0,3 мМ гуанозин-5′-трифосфат (GTP) -Na ₂ , 10 мМ сахароза, 10 мМ HEPES и 0,2-0,5% биоцитин (pH 7,3 регулируется с помощью КОН , 300 мОсм, поддерживаемое сахарозой) с сопротивлением наконечника 6–8 МОм.

Последовательное сопротивление

контролировалось с интервалом 2 мин, и записи исключались, если последовательное сопротивление и ток утечки значительно менялись и / или превышали 40 МОм или 200 пА, соответственно.

Окрашивание серебром по Гольджи

Окрашивание серебром по шкале Гольджи

проводили, как описано ранее (Du, 2019).Мышей умерщвляли и перфузировали 4% PFA. Мозг препарировали, разрезали пополам на стыке между корой и средним мозгом и дополнительно инкубировали в растворе PFA в течение следующих 10 минут с последующим погружением в раствор Гольджи (FD Neurotechnologies, Rapid Golgi Kit). Раствор Гольджи был заменен через 6 часов, и мозг оставался погруженным в течение 2 недель перед проявлением в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью SPSS Statistics 22 и нанесены на график с помощью GraphPad Prism 8.0. Размер выборки был рассчитан на основе степени 0,95 и значения α 0,05. Все данные от мышей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а данные срезов мозга представлены как среднее ± стандартное отклонение. Различные группы лечения оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с тестом Тьюки для множественных сравнений. Нулевая гипотеза была отклонена, когда значение p было <0,05.

Результаты

DI-NBP снижает демиелинизацию и улучшает когнитивные нарушения в модели BCAS

Для изучения терапевтического потенциала D1-NBP в смягчении демиелинизации и когнитивных нарушений, вызванных гипоперфузией всего мозга, мы использовали модель мыши BCAS, в которой спирали были помещены вокруг двусторонних общих сонных артерий.После моделирования BCAS демиелинизация и когнитивные нарушения были значительными на 28 день после BCAS, что указывает на успешное моделирование VaD, вызванного гипоперфузией (рисунки 1A – F). В группе лечения D1-NBP мышам ежедневно вводили внутрижелудочно D1-NBP или плацебо через 1 день после BCAS до умерщвления. Состояние миелинизации в различных группах лечения оценивали с помощью ТЕМ. Можно было наблюдать, что гипоперфузия всего мозга с помощью BCAS изменила общее распределение аксонов G-ratio на более высокую скорость G-ratio, что сопровождается значительным увеличением G-ratio в группе BCAS.Хотя лечение низкими дозами D1-NBP (L-NBP, 50 мг / кг / день) не вызывало демиелинизации, повышенная доза лечения D1-NBP (H-NBP) до 100 мг / кг / день значительно уменьшала демиелинизация, вызванная BCAS (Рисунки 1A – C).

Рисунок 1. (A) Лечение высокими дозами Dl-3-n-бутилфталида (D1-NBP) смягчало демиелинизацию и улучшало когнитивные нарушения в модели двустороннего стеноза сонной артерии (BCAS). (A – C) Типичные изображения ПЭМ (A) и количественный анализ G-ratio (B, C) в Sham + Placebo, Sham + L-NBP, Sham + H-NBP, BCAS + Placebo , Группы BCAS + L-NBP и BCAS + H-NBP.Шкала 2 мкм. Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. n = 80 миелинизированных аксонов (20 аксонов на мышь, 4 мыши на группу). (D – F) Рабочая и эталонная память оценивались с помощью восьмилучевого радиального лабиринта. Нарушение рабочей памяти у мышей BCAS было исправлено введением высоких доз DI-NBP, о чем свидетельствуют менее повторные ошибки (D) и большее количество различных вариантов выбора (E) в группе BCAS + H-NBP. Нет существенной разницы в пространственной эталонной памяти между разными группами (F) .Двусторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета , n = 11 мышей в каждой группе. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение ( ^** p <0,01; ^*** p <0,001; нс: несущественные различия). L-NBP, низкая доза DI-NBP; H-NBP, высокая доза D1-NBP.

Далее мы оценили терапевтический эффект D1-NBP на когнитивное нарушение, вызванное BCAS, которое проверяли с помощью радиального лабиринта с восемью рукавами. В группе лечения BCAS мыши показали более высокие ошибки повторного посещения и меньший выбор другой руки в первых восьми записях, что указывает на значительное ухудшение рабочей памяти у мышей BCAS.Ошибки эталонной памяти показали, что BCAS не влиял на эталонную память. В соответствии с предыдущими результатами, лечение высокими дозами DI-NBP значительно смягчило нарушение рабочей памяти за счет BCAS (рисунки 1D – F). В целом мы обнаружили, что лечение высокими дозами DI-NBP позволило восстановить демиелинизацию и когнитивные нарушения, вызванные гипоперфузией всего мозга.

Облегчение демиелинизации и когнитивных нарушений с помощью лечения DI-NBP сопровождается снижением накопления митохондрий в аксонах

По сравнению с миелином аксоны более уязвимы для гипоксически-ишемической среды (Cui et al., 2020). Поскольку митохондрии и связанная с ними митохондриальная динамика являются основными терапевтическими мишенями D1-NBP в различных моделях заболеваний, мы пришли к выводу, что терапевтические цели D1-NBP при гипоксически-ишемической демиелинизации достигаются путем регулирования митохондриальной динамики аксонов у мышей BCAS. Обнаружив митохондриальную нагрузку среди аксонов с помощью ПЭМ, мы обнаружили, что митохондриальная нагрузка среди аксонов была значительно увеличена в группе BCAS, что сопровождалось аномальной морфологией митохондрий.Однако лечение высокими дозами DI-NBP значительно уменьшило митохондриальную нагрузку и уменьшило аномальную морфологию митохондрий у мышей BCAS (Рисунки 2A – D).

Рисунок 2 . Облегчение демиелинизации и когнитивных нарушений за счет лечения высокими дозами D1-NBP сопровождалось снижением накопления митохондрий среди аксонов. (A – D) Репрезентативные ПЭМ-изображения митохондриальной нагрузки в аксонах (A) и количественный анализ количества митохондрий на площадь (/ мкм ² ) (B) , длина митохондрий (C) и митохондрий диаметр (D) в группах Sham + Placebo, Sham + L-NBP, Sham + H-NBP, BCAS + Placebo, BCAS + L-NBP, BCAS + H-NBP.Шкала 2 мкм. Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Для анализа митохондриальной нагрузки на площадь n = 20 полей зрения (4 поля зрения на мышь, 5 мышей на группу). Для анализа длины митохондрий n = 50 (10 митохондрий на мышь, 5 мышей на группу). Для анализа диаметра митохондрий n = 50 (10 митохондрий на мышь, 5 мышей на группу). (E, F) Иммуноблот (E) и количественный анализ (F) синтафилина (SNPH), Miro1 и Milton в разных группах.Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки, n = 8 мышей на группу. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение ( ^* p <0,05; ^** p <0,01; ^*** p <0,001; нс, несущественные различия).

Митохондриальная нагрузка среди аксонов дополнительно определялась митохондриальной динамикой и моторными белками, которые лежат в основе изменений в митохондриальной динамике. Мы исследовали белковые изменения, связанные с митохондриальной динамикой.Хотя моторные белки, такие как Miro и Milton, не показали значительных изменений после BCAS, SNPH, который прикрепил митохондрии к микропробирке, показал значительное повышение после BCAS. Интересно, что обработка высокими дозами D1-NBP значительно снижала экспрессию SNPH, указывая на то, что обработка высокими дозами DI-NBP уменьшала накопление митохондрий, вероятно, за счет ингибирования экспрессии SNPH (рис. 2E, F).

DI-NBP снижает накопление митохондрий, способствуя митохондриальной динамике

Чтобы дополнительно прояснить механизмы, лежащие в основе уменьшенного накопления митохондрий с помощью D1-NBP, мы создали модель in vitro гипоперфузии путем создания хронических состояний LGLO в культуре, содержащей срезы мозжечка.Мы использовали лентивирус для сверхэкспрессии SNPH, и срезы мозжечка были трансфицированы за 72 часа до обработки LGLO. Сразу после обработки LGLO в культуральную среду добавляли D1-NBP в дозе 50 мкМ и через 48 часов оценивали митохондриальную динамику.

Мы обнаружили, что обработка LGLO значительно увеличивала митохондриальную нагрузку, что сопровождалось снижением митохондриальной динамики, о чем свидетельствовало увеличение количества стационарных митохондрий после LGLO. Интересно, что лечение DI-NBP спасло динамическое падение LGLO и уменьшило митохондриальную нагрузку среди аксонов.Поскольку мы обнаружили, что обработка высокими дозами DI-NBP снижает нагрузку на митохондрии за счет ингибирования экспрессии SNPH in vivo , мы дополнительно сверхэкспрессировали SNPH на культивируемых срезах и обнаружили, что нагрузка на митохондрии снижается за счет высокой дозы DI- NBP был отменен SNPH OE (Рисунки 3A – D).

Рисунок 3. (A) Обработка высокими дозами D1-NBP снижает накопление в митохондриях, способствуя митохондриальной динамике. (A – D) Типичный кимограф (A) и количественный анализ процента стационарных, антероградных и ретроградных митохондрий в аксонах (B) , митохондриальной нагрузки на 50 мкм (C) и митохондриальной размер (D) в срезах мозжечка, подвергнутых воздействию Ctrl + фосфатно-солевой буфер (PBS), Ctrl + NBP, Ctrl + SNPH OE, Ctrl + SNPH OE + H-NBP, низкий уровень глюкозы и низкий уровень кислорода (LGLO) + PBS, LGLO + NBP, LGLO + SNPH OE, LGLO + SNPH OE + H-NBP.Лечение высокими дозами D1-NBP облегчало вызванное LGLO нарушение ретроградного и антероградного митохондриального транспорта. Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Для анализа процентного содержания стационарных, антероградных и ретроградных митохондрий n = 60 митохондрий на группу. Для митохондриальной нагрузки на анализ 50 мкм n = 20 аксонов на группу. Для анализа размера митохондрий n = 400 на группу. Масштабная линейка 50 мкм и 5 мин соответственно. Данные представлены в виде средних значений ± SEM ( ^* p <0.05; ^** p <0,01; ^*** p <0,001; нс, различия незначительны).

Улучшенная динамика митохондрий с помощью DI-NBP снижает демиелинизацию за счет снижения продукции ROS среди аксонов

Функциональная динамика митохондрий играет решающую роль в поддержании митохондриального гомеостаза. Нарушение транспортировки митохондрий и митохондриальная перегрузка в аксонах вредны для нейронов, особенно с точки зрения нарушения очистки неисправных митохондрий за счет ретроградного транспорта (López-Doménech et al., 2018). Сообщалось также, что повышенная продукция ROS повреждает миелинизацию в модели рассеянного склероза (MS) (Su et al., 2013). Таким образом, мы обнаружили продукцию АФК в митохондриях после LGLO. Мы обнаружили, что продукция ROS была повышена после LGLO, но обработка D1-NBP значительно снизила ROS среди аксонов и уменьшила общую продукцию ROS (Рисунки 4A – C). Таким образом, нарушение митохондриальной динамики отвечает за накопление митохондрий и значительно увеличивает продукцию АФК среди аксонов.Это вредно для миелинизации, о чем свидетельствует значительно сниженная экспрессия MBP, экспрессия NF и соотношение MBP / NF в группе LGLO. DI-NBP смягчает миелинизацию, которая зависит от SNPH (Рисунки 4D-G).

Рисунок 4 . Усиленный ретроградный транспорт митохондрий за счет обработки высокими дозами D1-NBP облегчал демиелинизацию за счет уменьшения продукции ROS среди аксонов. (A – C) Репрезентативные конфокальные изображения (A) и количественный анализ экспрессии ROS (B) и количества положительных аксонов ROS (C) .Шкала 100 мкм. Обработка высокими дозами D1-NBP уменьшала индуцированное LGLO образование АФК. Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки, n = 8 срезов на группу. (D – G) Репрезентативные конфокальные изображения (D) и количественный анализ экспрессии мальтозо-связывающего белка (MBP) (зеленый) (E) , экспрессии NF (красный) (F) и MBP / Коэффициент NF (G) . Высокая доза лечения DI-NBP уменьшала демиелинизацию, вызванную LGLO. Масштабная линейка 50 мкм.Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. n = 8 ломтиков на группу. Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего ( ^* p <0,05; ^** p <0,01; ^*** p <0,001; нс, несущественные различия).

В совокупности обработка DI-NBP уменьшала продукцию ROS среди аксонов и спасала миелинизацию, которая связана с улучшенным ретроградным транспортом митохондрий митохондриями.

Улучшенная динамика митохондрий с помощью DI-NBP восстанавливает нарушенную передачу сигналов нейронных синапсов

Антероградный транспорт митохондрий пополняет свежие митохондрии, необходимые для синаптической функции (Hollenbeck and Saxton, 2005; Lovas and Wang, 2013).Поскольку мы обнаружили повышенный антероградный митохондриальный транспорт, мы затем протестировали изменения в передаче сигналов синапса после лечения DI-NBP и при LGLO с помощью патч-зажима. Обработка LGLO привела к значительному падению скорости выстрела при всех амплитудах впрыска, и наиболее значительное падение скорости выстрела наблюдалось при впрыскивании относительно небольшого тока. Однако лечение DI-NBP спасало внутреннюю возбудимость нейронов, а SNPH OE в некоторой степени отменяло терапевтический эффект D1-NBP (Рисунки 5A – C).Мы дополнительно протестировали изменения в синаптической передаче сигналов после LGLO. И амплитуда, и частота mEPSC резко снизились после лечения LGLO, тогда как высокая доза DI-NBP восстановила падение амплитуды и частоты mEPSC, а SNPH OE отменила эти терапевтические эффекты (рисунки 5D – F). Кумулятивный анализ кривой распределения mEPSC показал, что лечение D1-NBP привело к значительно большей амплитуде mEPSC и меньшим интервалам между mEPSC (рисунки 5G, H). Эти результаты показали, что D1-NBP способствует внутренней возбудимости нейронов и функции синапсов, которая связана с митохондриальным антероградным транспортом.

Рисунок 5 . Повышенный антероградный транспорт митохондрий за счет обработки высокими дозами D1-NBP восстановил нарушенную передачу сигналов синапсов нейронов. (A – C) Типичные реакции возбуждения (A) на деполяризующие (175 пА) и гиперполяризационные (-50, -135 и -200 пА) текущие инъекции и процент количественного анализа от контрольных скоростей возбуждения и (B) реакция скорости возбуждения на серию линейных инъекций тока (от -200 до -50 пА) (C) в различные обработанные срезы мозжечка.Двусторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета . Для процента анализа скорости возбуждения управления n = 9 нейронов на группу (3 нейрона на срез). Для реакции скорости возбуждения на серию линейного анализа инжекции тока n = 9 нейронов на группу (3 нейрона на срез). (D – H) Репрезентативные трассы mEPSC (D) и количественный анализ частоты миниатюрного возбуждающего постсинаптического тока (mEPSC) (E) , амплитуды (F) и кумулятивного распределения интервала между mEPSC ( G) и mEPSCamplitude (H) .В условиях LGLO нарушенная собственная нейрональная возбудимость и функция синапсов показали заметное улучшение при лечении H-NBP. Для частоты и амплитуды mEPSC — односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Для кумулятивного распределения интервала между mEPSC и амплитуды mEPSC используется тест Манна – Уитни. Для частоты mEPSC n = 30 на группу. Для амплитуды mEPSC n = 30 на группу. Для кумулятивного распределения интервала между mEPSC n = 4291 на группу. Для кумулятивного распределения амплитуды mEPSC n = 4319 на группу.Шкала шкалы: 10 пА и 100 мс соответственно. Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего ( ^*** p <0,001; нс, несущественные различия).

DI-NBP снижает демиелинизацию и когнитивные нарушения путем ингибирования SNPH

in vivo

На основании наших результатов in vitro о том, что SNPH OE устраняет эффекты DI-NBP в стимулировании митохондриальной динамики, мы дополнительно подтвердили, лежит ли SNPH в основе эффектов DI-NBP в смягчении демиелинизации и когнитивных нарушений в модели BCAS.SNPH, сверхэкспрессирующий AAV 2/9, стереоскопически вводили в боковые желудочки новорожденных мышей. Операция BCAS была проведена в возрасте 2 месяцев. Мы обнаружили, что SNPH OE значительно отменяет терапевтический эффект D1-NBP на смягчение демиелинизации, на что указывает повышенное G-соотношение после SNPH OE в группе лечения высокими дозами DI-NBP (рисунки 6A, B). Между тем, снижение митохондриальной нагрузки и восстановление морфологии митохондрий в группе, получавшей высокие дозы DI-NBP, также были уменьшены за счет SNPH OE (Рисунки 6C-E).Более того, увеличение синапсов за счет лечения высокими дозами D1-NBP было потеряно в группе DI-NBP + SNPH OE, что сопровождалось меньшим количеством грибовидных синапсов (Рисунки 6F – H). От улучшенной рабочей памяти с помощью DI-NBP отказались от SNPH OE (Рисунки 6I – K).

Фигура 6. (A) Лечение высокими дозами D1-NBP смягчало демиелинизацию и когнитивные нарушения, спасая митохондриальную динамику in vivo . (A – E) Репрезентативные изображения ПЭМ, отображающие состояние миелинизации (верхняя панель) и митохондриальную нагрузку в аксонах (A) и количественный анализ G-ratio (B) , митохондриальной нагрузки на площадь (C) , длина митохондрий (D) и диаметр митохондрий (E) в группах BCAS + плацебо, BCAS + H-NBP, BCAS + SNPH OE и BCAS + SNPH OE + H-NBP.Терапевтические эффекты H-NBP по смягчению демиелинизации и когнитивных нарушений зависели от динамики митохондрий. Шкала 2 мкм. Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Для G-ratio n = 80 миелинизированных аксонов. Для анализа митохондриальной нагрузки на площадь n = 20 полей зрения (4 поля зрения на мышь, 5 мышей на группу). Для анализа длины митохондрий n = 50 (10 митохондрий на мышь, 5 мышей на группу). Для анализа диаметра митохондрий n = 50 (10 митохондрий на мышь, 5 мышей на группу). (F – H) Типичные изображения окрашивания серебром. (F) Количественный анализ количества игл на 10 мкм. (G) Различные виды морфологии позвоночника в разных группах (H) . Односторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки. Для количества шипов на анализ 10 мкм n = 10 аксонов на мышь, 5 мышей на группу. Для различных видов анализа морфологии позвоночника n = 10 аксонов на мышь, 5 мышей на группу. Шкала 10 мкм. (I – K) Рабочая и эталонная память оценивались с помощью радиального лабиринта с восемью рукавами.Улучшение рабочей памяти с помощью H-NBP у мышей BCAS было отменено с помощью SNPH OE, о чем свидетельствует увеличение количества ошибок повторного посещения. (I) Меньше различных вариантов (J) в группе BCAS + H-NBP + SNPH OE. Нет существенной разницы в пространственной эталонной памяти между разными группами (K) . Двусторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета , n = 11 мышей в каждой группе. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение ( ^* p <0.05; ^** p <0,01; ^*** p <0,001; нс, различия незначительны).

Из приведенных выше результатов мы могли сделать вывод, что терапевтический потенциал D1-NBP в отношении смягчения демиелинизации и когнитивных нарушений при гипоксически-ишемической демиелинизации был достигнут путем отмены повышения SNPH среди аксонов, что восстановило нарушенную митохондриальную динамику и способствовало антероградному влиянию митохондриальный транспорт для передачи сигналов синапса и ретроградный митохондриальный транспорт для уменьшения АФК за счет митофагии.

Обсуждение

Результаты настоящего исследования продемонстрировали влияние Dl-NBP на смягчение демиелинизации, а также влияние Dl-NBP на стимулирование митохондриальной динамики аксонов в WML с использованием модели мышей BCAS, а также культуры срезов мозга in vitro лечился ЛГЛО. Наши результаты продемонстрировали, что митохондриальная динамика была подавлена, в то время как статические митохондрии накапливались в аксонах после повреждения ишемии / гипоксии, которое было опосредовано повышенной экспрессией SNPH, аксонально-специфичного арочного белка.Лечение высокими дозами Dl-NBP улучшило антероградный и ретроградный транспорт митохондрий и уменьшило накопление митохондрий в аксонах, тем самым остановив разрушение миелина и улучшив электрическую функцию синапса. Лечение высокими дозами D1-NBP также улучшило количество синапсов и когнитивные функции. Кроме того, мы исследовали механизм D1-NBP и обнаружили, что лечение высокими дозами D1-NBP подавляло экспрессию SNPH. SNPH OE отменил защитную функцию D1-NBP в уменьшении демиелинизации и улучшении когнитивной функции.

Поражения белого вещества, также называемые лейкоареозом, очень распространены и считаются важным фактором снижения когнитивных функций, особенно у пожилых людей (Alber et al., 2019). Первичные цереброваскулярные патологии, вызывающие WML, включают мультиартериолосклероз, стеноз сонной артерии или окклюзию, которые приводят к гипоперфузии головного мозга в глубоких областях белого вещества (van Norden et al., 2011). Белое вещество, состоящее из пучков миелинизированных аксонов, играет жизненно важную роль в передаче сигналов.Сообщалось, что лечение Dl-NBP улучшало дефицит обучения и памяти, вызванный хронической гипоперфузией головного мозга на животной модели (Li et al., 2019). Мы предполагаем, что Dl-NBP улучшает когнитивные функции при гипоперфузии частично за счет предотвращения разрушения миелина и увеличения передачи сигнала. В настоящем исследовании мы также наблюдали, что лечение D1-NBP улучшило когнитивные нарушения в модели BCAS. Затем мы исследовали влияние D1-NBP на демиелинизацию, поскольку неповрежденный и функциональный миелин является структурной основой электрического сигнала, идущего от тела клетки вниз по синапсу аксона.Результаты показали, что лечение высокими дозами D1-NBP значительно уменьшало демиелинизацию по сравнению с модельной группой BCAS. Далее мы оценили передачу сигналов синапса, которая связана с активностью центральной холинергической системы. Результаты показали, что высокая доза D1-NBP способствовала внутренней возбудимости нейронов и функции синапсов по сравнению с группой модели BCAS. Эти два нейропротекторных аспекта D1-NBP в конечном итоге способствовали восстановлению когнитивной функции после BCAS.

Белое вещество более подвержено хронической гипоперфузии головного мозга, чем серое вещество, которое включает как аксональный, так и миелиновый компоненты (Wakita et al., 2002). Миелин вырабатывается олигодендроцитами, которые прикреплены к аксонам и, следовательно, могут взаимодействовать с аксонами в центральной нервной системе. В процессе демиелинизации, вызванной гипоперфузией, аксональные изменения нельзя игнорировать. Недавно сообщалось, что деградация аксонов сопровождается укорочением митохондрий в модели in vitro WML (Cui et al., 2020). В нашем исследовании мы наблюдали митохондрии неправильной формы у мышей BCAS, которые показали увеличенную длину и уменьшенный диаметр.После лечения высокими дозами Dl-NBP морфологические изменения митохондрий значительно восстановились. Митохондрии являются наиболее чувствительными организмами к гипоксии и быстро реагируют на ишемическое поражение. Обычно митохондрии претерпевают массовые процессы слияния и деления, а также транспортировку по аксонам, чтобы непрерывно поддерживать свою функцию и поддерживать снабжение клеток энергией (Youle and van der Bliek, 2012; Lee and Yoon, 2016; Meyer et al., 2017). Нарушение баланса митохондриальной динамики происходит при гипоперфузии.Между тем, мы наблюдали увеличение количества аномальных митохондрий, накопленных в аксонах мышей BCAS, но обработка высокими дозами D1-NBP уменьшала их накопление. Эти результаты показали, что Dl-NBP воздействует на митохондрии аксонов, облегчая демиелинизацию.

Синтафилин — это основной закрепляющий митохондрии белок, нацеленный на аксоны (Joshi et al., 2019). Делеция SNPH дает поразительные преимущества в модели демиелинизации MS, продлевая выживаемость, уменьшая повреждение мозжечка, подавляя окислительный стресс и улучшая здоровье митохондрий (Joshi et al., 2015). Позже мы исследовали уровни SNPH и обнаружили высокую экспрессию SNPH у мышей BCAS, сопровождающуюся увеличением количества стационарных митохондрий в аксонах. Обработка высокой дозой D1-NBP ингибировала уровни SNPH, что затем способствовало как антероградному, так и ретроградному транспорту митохондрий. Благодаря SNPH OE защитные эффекты D1-NBP в отношении уменьшения демиелинизации исчезли. Кроме того, была отменена защита когнитивной функции. Таким образом, мы обнаружили, что SNPH является новой мишенью для D1-NBP в индуцированной гипоперфузией WML.

Одна из основных ролей митохондрий — продуцировать АТФ. Антероградный транспорт митохондрий увеличивает митохондриальное дыхание и продукцию АТФ (Roger et al., 2017; Rangaraju et al., 2019). Повышенный антероградный транспорт митохондрий может помочь аксонам поддерживать энергетическую стабильность, и это, вероятно, лежит в основе улучшенной функции передачи сигналов синапсов в группе, получавшей высокие дозы D1-NBP. Ретроградный транспорт митохондрий вызывает митофагию дисфункциональных митохондрий, что снижает выработку АФК.Поскольку миелин чувствителен к АФК, снижение продукции АФК у мышей, получавших D1-NBP, может объяснить защиту миелина и сохранить структуру синапсов нетронутой.

В заключение, наши результаты показывают, что высокая доза D1-NBP ингибирует экспрессию SNPH, который является аксонально-специфическим митохондриальным изгибающим белком. Ингибирование SNPH с помощью D1-NBP снижает митохондриальную нагрузку среди аксонов и способствует антероградному и ретроградному митохондриальному транспорту, который затем спасает демиелинизацию и когнитивные функции в модели WML.Эти результаты нашего исследования позволяют предположить, что Dl-NBP является многообещающим методом лечения когнитивной дисфункции и демиелинизации при WML.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено этическим комитетом Университета Фудань, Шанхай, Китай.Письменное информированное согласие было получено от владельцев на участие их животных в этом исследовании.

Взносы авторов

YWF и MG подготовили рукопись. YWF и SH провели эксперимент. YWF и HZ помогли со статистикой и подготовкой цифр. MC и QD разработали эксперимент. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81971013 для MC; 81870915 и 81571109 для QD) и грантом Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (16411970200).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сокращения

WML, поражения белого вещества; АП, потенциалы действия; BCAS, двусторонний стеноз общей сонной артерии; LGLO, низкий уровень глюкозы и низкий уровень кислорода; mEPSC, миниатюрный возбуждающий постсинаптический ток; Рассеянный склероз; СНПХ, синтафилин; ПЭМ, просвечивающая электронная микроскопия; VaD, сосудистая деменция.

Список литературы

Альбер, Дж., Аллади, С., Бэ, Х. Дж., Бартон, Д. А., Беккет, Л. А., Белл, Дж. М. и др. (2019). Гиперинтенсивность белого вещества в сосудах, влияющих на когнитивные нарушения и деменцию (VCID): пробелы в знаниях и возможности. Alzheimers Dement 5, 107–117. DOI: 10.1016 / j.trci.2019.02.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барджела Д., Берр С. П. и Чиннери П. Ф. (2018). Митохондрии и гипоксия: метаболические перекрестные помехи в решениях клеточной судьбы. Trends Endocrinol. Метаб . 29, 249–259. DOI: 10.1016 / j.tem.2018.02.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бен-Ари, Х., Лифшитц, Т., Вольф, Г., Ригби, А., Блюменфельд-Кацир, Т., Мерзель, Т. К. и др. (2019). Поражения белого вещества, церебральное воспаление и когнитивные функции на мышиной модели гипоперфузии головного мозга. Brain Res . 1711, 193–201. DOI: 10.1016 / j.brainres.2019.01.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Д., Инь, Ю., Ши, Дж., Ян, Ф., Ван, К., Чжао, Ф. и др. (2020). DL-3-н-бутилфталид улучшает церебральную гипоперфузию у пациентов с большим церебральным атеросклеротическим стенозом: одноцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование. BMC Neurol . 20: 212. DOI: 10.1186 / s12883-020-01801-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, J., Liu, N., Wang, X., Zhao, Y., He, J., Yang, L., et al. (2019). Dl-3-n-бутилфталид подавляет индуцированный фенитоином апоптоз нейронов в гиппокампе и мозжечке крыс. J. Integr. Neurosci . 18, 277–283. DOI: 10.31083 / j.jin.2019.03.174

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, N., Zhou, Z., Li, J., Li, B., Feng, J., He, D., et al. (2018). 3-н-бутилфталид оказывает нейропротекторное действие, усиливая антиоксидантное действие и ослабляя митохондриальную дисфункцию в модели in vitro ишемического инсульта. Drug Des. Devel. Ther . 12, 4261–4271. DOI: 10.2147 / DDDT.S189472

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куй, Л.Y., Zhu, Y.C, Gao, S., Wang, J.M., Peng, B., Ni, J., et al. (2013). Назначение dl-3-n-бутилфталида в течение девяноста дней при остром ишемическом инсульте: рандомизированное двойное слепое исследование. Подбородок. Med. J . 126, 3405–3410. DOI: 10.3760 / cma.j.issn.0366-6999.20123240

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цуй, Й., Джин, X., Чой, Д. Дж., Чой, Дж. Й., Ким, Х. С., Хван, Д. Х. и др. (2020). Дегенерация аксонов в модели in vitro ишемического повреждения белого вещества. Neurobiol. Dis . 134: 104672. DOI: 10.1016 / j.nbd.2019.104672

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Датта Г., Коласанти А., Рабинер Э. А., Ганн Р. Н., Малик О., Чиккарелли О. и др. (2017). Нейровоспаление и его связь с изменениями объема мозга и поражениями белого вещества при рассеянном склерозе. Мозг 140, 2927–2938. DOI: 10.1093 / мозг / awx228

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фэн Ю.W., Huang, Y.Q., Yan, Y., Li, G., He, X.F., Liang, F.Y., et al. (2020a). Фазовая передача сигналов ГАМК опосредует защитные эффекты cTBS против церебральной ишемии у мышей. Neurosci. Lett . 715: 134611. DOI: 10.1016 / j.neulet.2019.134611

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Feng, Y. W., Wu, C., Liang, F. Y., Lin, T., Li, W.Q., Jing, Y.H., et al. (2020b). hUCMSCs ослабляют LPS-индуцированный тренированный иммунитет при ишемическом инсульте. Фронт. Иммунол .11: 1746. DOI: 10.3389 / fimmu.2020.01746

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го, М., Ма, X., Фэн, Ю., Хан, С., Донг, К., Цуй, М., и др. (2019). При хронической гипоксии доступность глюкозы и тяжесть гипоксии определяют баланс между HIF-1 и HIF-2 в астроцитах. FASEB J . 33, 11123–11136. DOI: 10.1096 / fj.2012RR

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холленбек, П. Дж., И Сакстон, В.М. (2005). Аксональный транспорт митохондрий. J. Cell Sci . 118 (Pt 23), 5411–5419. DOI: 10.1242 / jcs.02745

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джоши, Д. К., Чжан, К. Л., Бабуджи, Л., Вевеа, Д. Д., Август, Б. К., Шэн, З. Х. и др. (2019). Неправильное внедрение аксонального митохондриального якоря в дендриты вызывает нейродегенерацию. Cell Rep . 29, 685–696.e5. DOI: 10.1016 / j.celrep.2019.09.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джоши, Д.К., Чжан, К. Л., Лин, Т. М., Гусаин, А., Харрис, М. Г., Три, Э. и др. (2015). Удаление митохондриального закрепления защищает дисмиелинизирующую дрожь: последствия для прогрессирующего рассеянного склероза. Дж. Neurosci . 35, 5293–5306. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.3859-14.2015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., Юн, Ю. (2016). Деление и слияние митохондрий. Biochem. Soc. Транс . 44, 1725–1735. DOI: 10.1042 / BST20160129

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лема, А., Бишоп, К., Малик, О., Маттоцио, М., Али, Р., Николас, Р. и др. (2017). Сравнение методов переноса намагниченности для оценки микроструктуры головного и шейного отделов спинного мозга при рассеянном склерозе. J. Neuroimaging 27, 221–226. DOI: 10.1111 / jon.12377

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, В., Вэй, Д., Лин, Дж., Лян, Дж., Се, X., Сонг, К., и др. (2019). Dl-3-n-бутилфталид снижает когнитивные нарушения, вызванные хронической гипоперфузией головного мозга, посредством передачи сигналов GDNF / GFRα1 / Ret, предотвращая апоптоз нейронов гиппокампа. Фронт. Клетка. Neurosci . 13: 351. DOI: 10.3389 / fncel.2019.00351

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Линь, М. Ю., Ченг, X. Т., Тамминени, П., Се, Ю., Чжоу, Б., Цай, К., и др. (2017). Высвобождение синтафилина удаляет стрессовые митохондрии из аксонов независимо от митофагии в патофизиологических условиях. Нейрон . 94, 595–610.e6. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.04.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лопес-Доменек, Г., Covill-Cooke, C., Ivankovic, D., Halff, E.F., Sheehan, D.F., Norkett, R., et al. (2018). Белки Miro координируют микротрубочки и актин-зависимый митохондриальный транспорт и распределение. EMBO J . 37, 321–336. DOI: 10.15252 / embj.201696380

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паликарас, К., Лионаки, Э., и Тавернаракис, Н. (2015). Координация митофагии и митохондриального биогенеза при старении у C. elegans. Природа 521, 525–528.DOI: 10.1038 / природа14300

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рангараджу В., Льюис Т. Л. мл., Хирабаяши Ю., Бергами М., Мотори Э., Картони Р. и др. (2019). Плейотропные митохондрии: влияние митохондрий на развитие нейронов и болезни. Дж. Neurosci . 39, 8200–8208. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1157-19.2019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sun, Y., Cheng, X., Wang, H., Mu, X., Лян Ю., Луо Ю. и др. (2017). dl-3-n-бутилфталид способствует нейропластичности и восстановлению моторики у крыс, перенесших инсульт. Behav. Мозг Res . 329, 67–74. DOI: 10.1016 / j.bbr.2017.04.039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Томас, Л. В., и Эшкрофт, М. (2019). Изучение молекулярного интерфейса между передачей сигналов фактора, индуцируемого гипоксией, и митохондриями. Ячейка. Мол. Life Sci . 76, 1759–1777. DOI: 10.1007 / s00018-019-03039-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиан, А., Ли В., Зай К., Ли Х. и Чжан Р. У. (2020). 3-N-бутифталид улучшает обучение и память у крыс с сосудистыми когнитивными нарушениями за счет активации пути SIRT1 / BDNF. Мол. Med. Репу . 22, 525–533. DOI: 10.3892 / mmr.2020.11106

CrossRef Полный текст | Google Scholar

van Norden, A.G., de Laat, K.F., Gons, R.A., van Uden, I.W., van Dijk, E.J., van Oudheusden, L.J., et al. (2011). Причины и последствия заболевания мелких сосудов головного мозга. Исследование RUN DMC: проспективное когортное исследование.Обоснование и протокол исследования. BMC Neurol . 11:29. DOI: 10.1186 / 1471-2377-11-29

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wakita, H., Tomimoto, H., Akiguchi, I., Matsuo, A., Lin, J. X., Ihara, M., et al. (2002). Повреждение аксонов и демиелинизация в белом веществе после хронической гипоперфузии головного мозга у крыс. Brain Res . 924, 63–70. DOI: 10.1016 / S0006-8993 (01) 03223-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, К.Y., Xu, Y., Wang, X., Guo, C., Wang, T., and Wang, Z. Y. (2019). Dl-3-n-бутилфталид ингибирует инфламмасому NLRP3 и смягчает патологию, подобную болезни Альцгеймера, через ось Nrf2-TXNIP-TrX. Антиоксид. Редокс-сигнал . 30, 1411–1431. DOI: 10.1089 / ars.2017.7440

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, S., Ma, F., Huang, L., Zhang, Y., Peng, Y., Xing, C., et al. (2018). Dl-3-n-бутилфталид (NBP): многообещающий терапевтический агент при ишемическом инсульте. CNS Neurol. Disord. Drug Targets 17, 338–347. DOI: 10.2174 / 1871527317666180612125843

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Xu, H., Baracskay, P., O’Neill, J., and Csicsvari, J. (2019). Ответы сборки клеток места СА1 гиппокампа предсказывают усвоенное поведение в целенаправленных пространственных задачах в радиальном восьмилучевом лабиринте. Нейрон 101, 119–132.e4. DOI: 10.1016 / j.neuron.2018.11.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сюэ, Л.-X., Zhang, T., Zhao, Y.-W., Geng, Z., Chen, J.-J., and Chen, H. (2016). Сравнение эффективности и безопасности DL-3-н-бутилфталида и церебролизина: влияние на неврологические и поведенческие исходы при остром ишемическом инсульте. Exp. Ther. Мед . 11, 2015–2020 гг. DOI: 10.3892 / etm.2016.3139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян, С. С., Го, А., Ли, Ю., Ши, К., Ши, Ф. Д., и Ли, М. (2019). Dl-3-n-бутилфталид уменьшает нервно-сосудистое воспаление и ишемическое повреждение головного мозга у мышей. Диск старения . 10, 964–976. DOI: 10.14336 / AD.2019.0608

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юле, Р. Дж., И ван дер Блик, А. М. (2012). Деление, слияние и стресс митохондрий. Наука 337, 1062–1065. DOI: 10.1126 / science.1219855

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zheng, Y., Wu, X., Chen, Z., and Zhang, X. (2019). Приходите и ешьте: митохондриальный транспорт направляет митофагию в ишемизированных нейрональных аксонах. Аутофагия 15, 1483–1484. DOI: 10.1080 / 15548627.2019.1618099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Технические характеристики Kryq Dongfeng h40. Dongfeng h40 Cross: në ndjekje të modës

Диса кохэ мэ пара, бота и автообилаве пэркафои нджэ прирже тэ ре — продхуэсит фулуан тэ кэрконин нджэ компромис мидис нджэ крикезими дхе нджэ рджедхже урбан. Si rezultat, makinat kompakte, por praktike me hapësirë ​​lartë të pastrimit nga toka dhe atribute jashtë rugës, por në të njëjtën kohë që kishin rrota të pëjëjën kohë që kishin rrota të pëjëjë mundur përdorimin e tyre për disa qëllime menjëherë

Duhet pranuar që kërkesa për modele të tilla doli të ishte papritur e lartë dhe kjo vend filloi të mbushej gradientisht me oferta konkurruese nga markat e famshme.Kinezët gjithashtu vendosën të mos qëndronin larg nga trendi i ri dhe premtues, kështu që ata ishin një nga të parët që paraqitën identity e tyre — Dong Feng N30 Cross.

Si u tregua ai në luftën kundër kundërshtarëve?

Dongfeng DFM h40 Cross debutoi në treg në 2011. Makina pothuajse menjëherë tërhoqi interes nga njerëzit e zakonshëm dhe ekspertët e automjeteve, jo vetëm për shkak të dizajöhörës të dizajërë tërës tëdizajörës të dizajärë tërë.

Në fakt, Dong Feng N30 me prefiksin Cross i përket segmentit B dhe u drejtohet banorëve urban me një nivel mesatar të të ardhurave.Në të njëjtën kohë, prodhuesi e pozicionon këtë model si një makinë që lejon të gjithë familjen të dalë me pushime në një vend.

Në tregun rus, SUV i ri kinez paraqitet në dy modifikime: Rehati dhe Luksoze. Për opsionin e parë, shitësit e markave kërkojnë 649 mijë e 900 rubla, çmimi i versionit më të lartë është 709 mijë rubla.

Në varësi të paketës së zgjedhur të pajisjeve, ajo përfshin:

• Timon shumëfunksional.
• Мультимедийный комплекс me një ekran me ngjyra, lidhës USB.
• Системы и лундримит.
• Dritare elektrike për dyert e përparme, të pasme.
• Kondicioner.
• Ndihma e parkimit të kundërt.
• Лука дхе мэ шумэ.

Specifikimet

Nën kapakun e Dongfeng h40 Cross është një njësi atmosferike 1,6 литровый индекс и фабрики A16. Isshtë e pajisur me një sistem aktiv të kohës së ndryshimit të valvulave dhe është i aftë të gjenerojë ose 117 ose 106 kuaj fuqi.

Transmisioni bazë është një «mekanikë» me pesë shpejtësi, dhe një alternativë ndaj tij është një transmetim automatik me katër shpejtësi.

Parametrat e trupit:

Dong Feng N30 Cross bazohet në një platformë me rrota të përparme. База э рротаве высотой 2 метра 610 миллиметра. Pezullimi i përparmë është projektuar sipas skemës McPherson, ndërsa pjesa e pasme është një dizajn klasik me shumë lidhje.

Rishikimi i pronarit

Kërkesa për këtë veturë nuk mund të quhet e ulët. Sidoqoftë, në vitet e fundit ajo ka qenë në rënie të vazhdueshme për shkak të faktit se modeli është tashmë i vjetëruar moralisht.Ме поштэ шта история и пронарит тэ DongFeng h40 Cross, е цила трегон на функсионимин 1,5-vjeçar тэ кешай макинэ.

Makina u ble e re në konfigurimin «Комфорт» me një ручная трансмиссия dhe një мотор 1,6 литра мне 117 kuaj fuqi. Tani kilometrazhi është 57 mijë kilometra, gjë që na lejon të nxjerrim përfundime të caktuara në lidhje me periudhën e pronësisë.

Filloni me besueshmëri. Дери në 30 mijë kilometra, Dong Feng N30 Cross NUK дха в NJE arsye PER ndonjë mosfunksionim, Пор нга 32 mijë Doli се ishte е nevojshme të zëvendësoja amortizatorët е përparmë QE rrjedhin, megjithëse Une duhej të vozisja ekskluzivisht në rrugë меня cilësi të ХОРОШО.Në 47 mijë, ai zëvendësoi kompresorin e kondicionimit të ajrit, dhe rreth 52,000 kilometra — raftin e drejtimit.

Riparimet e paplanifikuara më shqetësuan pak, ndërsa çmimet për pjesë rezervë nuk janë aspak të ulëta. Sidoqoftë, nëse flasim për veturën vetë, atëherë përshtypjet për të janë mjaft pozitive.

Пикат и форта:

• Разгон букур.
• Консуми и прануешем и карбурантит.
• Trajtim i qartë.
• Pajisje të mira.

Anët e dobëta:

• Pezullimi i ashpër.
• Trungu i vogël.
• Cilësi mesatare e materialeve të brendshme të përfundimit.

Test Drive

Pamja e jashtme

Dizajni i jashtëm i Dongfeng h40 Cross është mjaft и veçantë. Внедорожник кинез është në gjendje të dalë nga masa totale me një grilë radiatori të kromuar, dritat e pjerrëta me drita LED të integruara, mbulesat e parakolpit pseudo-metalik dhe një çantë тэзэзэ тэзэзэ.

Binarët e çatisë sugjerojnë për dobinë e modelit.Са и пёркет пастримит тё токес, айо штэ э барабартэ мне 175 миллиметра, е цила штэ э мьяфтуешме ветэм пэр тэ капэрциер бордурат э ульта нэ кытет.

Dekorimi i brendshëm

Dizajni i rreptë i brendshëm kënaq syrin, gjë që nuk mund të thuhet për ndjesitë e prekshme. Cilësia e materialeve të përfundimit është sinqerisht buxhetore: plastikat gri të paneleve janë lisi në prekje, dhe materiali prej pëlhure i tapicerive të karrigeve është i ashpër.

Paneli është shpërndarë në tre puse.Vetëm informacioni bazë është para syve të shoferit, ndërsa funksionaliteti i kompjuterit udhëtues është i kufizuar.

Në pjesën e sipërme të konsolës qendrore, ekrani i kompjuterit në bord është i fshehur nën maskë. Поште тидж, мунд тэ гжеш нджэ монитор тджетэр, пор кешай здесь — система мультимедиа. Ai shfaq informacion jo vetëm për sistemin audio, por edhe për lundrim.

Ergonomia e sediljes së shoferit është e kënaqshme. Нэсе фласим пэр дукшмэри, атэхэрэ гжитчка штэ большой идеал — зона тэ вдекура крийохен пэр шкак тэ штренгимеве тэ трупит тэ гйерэ, си дхе паскыраве тэ вогла анэсоре.

Karakteristikat e vozitjes

Në qytetin Dongfeng, h40 Cross ndihet i sigurt. Динамика е mjaftueshme е makinës sigurohet nga një мотор меня frymë natyrale me 117 kuaj fuqi, dhe transmetimi automatik ndryshon ingranazhe, megjithëse me një vonesë, por mjaft mirë. Një transmetim manual mund të zhgënjejë me një pedale tufë me goditje të gjatë, joformalian dhe saktësi të ulët të ndërrimit.

Timoni i lehtë e bën më të lehtë manovrimin me shpejtësi të ulët dhe parkim të ngushtë, por me rritjen e shpejtësisë, përpjekja për të nuk ndryshon, gjë törëPezullimi i shtrënguar elleon rrotullat e forta gjatë kthesës, por funksionon shumë përplasje — kjo ndikon negativisht në udhëtim.

Vendimi: Dong Feng h40 Cross zotëron ato cilësi që mund të interesojnë si banorin e qytetit ashtu edhe banorin e fshatit. Isshtë mjaft praktike, e pajisur mirë dhe largësia e saj e lartë nga toka bën të mundur lëvizjen në rrugët e vendit. Sidoqoftë, komoditeti i udhëtimit dhe cilësia e përfundimit nuk mund të llogariten në pikat e forta të modelit.

Фотография и Dongfeng h40 Крест:

Një tjetër kompani kineze e automjeteve ka hyrë në tregun rus që nga mesi i majit të vitit të kaluar. Ata sollën në Rusi një sedan dhe një SUV, фоторобот без характеристик и шин. Ато ndryshojnë vetëm në llojet e trupit dhe lartësinë e pastrimit. Нен капак ата кане 117 куадж це фшихен нэ формен э нджэ мотори бензинме катер цилиндра 1,6 литра.

DongFeng h40 ka pastrim të mirë nga toka dhe dinamikë të mjaftueshme për ngarjen e qytetit dhe ngasjen jashtë rrugës.

Пак для компании

DongFeng нук është një zyrë sharashkin, por një korporatë kineze mjaft e shquar. В 1969 году он был назван таким образом, чтобы получить статус в e një prej prodhuesve më të mëdhenj të automjeteve në Mbretërinë e Mesme dhe fitoi kontrata me Citroen, Renault, Nissan dhe madje Volvo. Нга рруга, пуна и пёрбашкет ме кэтэ тэ фундит бёри кэ Восточный ветер (кэшту пёрктехет эмри и компанисэ) нэ продхуесин ме тэ мадх тэ камионэве нэ Кинэ. Нга рруга, камионэт е тире канэ пэршкуар рругэт е русисэ пэр мэ шумэ се нджэ мидже милже, пор ветурат тйешт по шфакен нэ трег.

Компания vendosi të fillojë me sedan S30 dhe mbikalesë h40. Ато у zhvilluan, natyrisht, Jo posaçërisht PER rrugët уловка, Пор пункт себе të fillonin shitjet, kinezët ngisnin rreth ду Milion kilometra në asfaltin TONE (ДНО në DISA Vende mungesa е Цы) në mënyrë QE të përshtatnin të ду makinat са м ХОРОШО PER të ашпэр куштет е русисэ.
А функционои?

Duhet të them se SUV doli të jetë mjaft e mirë.

Dongfeng h40 (meqë ra fjala, jo Dong Feng h40) ka pastrim të mirë nga toka dhe dinamikë të mjaftueshme për ngarjen e qytetit dhe ngasjen e lehtë jashtë rrugës.Сигуришт, нук до тэ зэвендэсоджэ нджэ внедорожник тэ плотэ меня корнизэ меня катэр ррота, пор мунд тэ konkurrojë меня кроссовер тэ тйерэ. Duket se Dongfeng vendosi të kenkurrojë me Lada Kalina Cross dhe Renault Sandero StepWay me këtë model.

Çfarë ka jashtë?

Nga pamja e jashtme, кроссовер duket si një Volvo XC70, dhe mjaft i fortë. Kjo mund të shihet si në siluetën e përgjithshme të makinës, ashtu edhe në elementtet e saj Individual dhe zgjidhjet e projektimit — parakolpët, radiatorët e rremë dhe dritat e pasme janë unike.Ata madje mund të jenë të këmbyeshëm, por kjo nuk është testuar ende. Disa makina me të cilat bëhen paralele në dukje janë dy Citroens: ZX dhe Xsara dhe Peugeout 306. Sidoqoftë, nuk është për t’u Habourur: përveç kontratave me Volvo, Dong Feng ka prodhuar të njëjté

Видео: Rishikimi DongFeng h40

Çfarë ka brenda?

Disa mbushje nën pjesën e poshtme të makinës gjithashtu nxisin shoqatat me Industrinë franceze të makinave:

1.Pezullimi, boshtet dhe drejtimi përsëritin saktësisht 306-të Peugeot dhe Citroen ZX. Nga rruga, në lidhje me pezullimin. Certifikata në rusisht në të bardhë thotë se pezullimi i pasmë i h40 Cross është i pavarur. Përfaqësuesit e kompanisë në Rusi e deklarojnë me zë të lartë këtë. Por Kina nuk do të ishte Kina nëse produkti i përfunduar përputhet plotësisht me parameter teknikë të deklaruar. Pezullimi i pasëm i kryqëzimit është në të vërtetë i varur, me një shirit rrotullimi tërthor. Ishte kjo që qëndroi në Peugeot e 306-të, dhe padyshim, kinezët e konsideruan atë të suksesshëm dhe vendosën të mos e preknin atë.

2. Energjia elektrike është një referencë e qartë për një vend tjetër të diellit që lind — Япония. Здесь вы найдете Suzuki или Mitsubishi, а также Nissan Tiida. Dhe kjo nuk është vetëm kjo: DongFeng gjithashtu mbledh Tiidën në Perandorinë Qiellore.

Nën pjesën e poshtme

Pjesa e poshtme e makinës. Аты фшихен тэ гджита плехрат типике тэ продхуесве кинезэ.

Nëse vuani (ose shijoni) perfeksionizëm, atëherë patjetër që nuk duhet të shikoni nën pjesën e poshtme të crossover.Мастика э штремберуар дхе э збатуар нэ мэнирэ тэ пабарабартэ (э чила вэретет вечанёришт нэ коше), мунгеса э нджэ памджеже тэ мжеруешме мбройтже нэ карремат и мусинэ мосхэма рэматга и нджанчжэ менджэ мосхэма и мобалрот и нджанджа менджэдже нэ карремат и мобалрот и нджанчжэ менджэдже нэ карремат и мусинджэ мосхэма и нджанджа. Por vlen të përmendet se me një pastrim toke prej 175 мм, asgjë nuk kërcënon karremat, veçanërisht pasi që kjo nuk është pjesa më e ulët e makinës — shkarkimi pezullohet mhabi të gjitës.

Нен капуч

Ne kemi thënë tashmë mjaft për motorin, por kutia e shpejtësisë vlen të përmendet veçmas.Ekzistojnë dy mundësi: një manual me pesë shpejtësi ose një automatik me katër shpejtësi. Makina automatike është mjaft e përshtatshme për udhëtime në qytet, dhe nëse makina duhet të drejtojë kryesisht në rrugë të papastra dhe të lehta jashtë rrugës, atëherë mejör

Kapaku në vetvete është mjaft i izoluar mirë nga zëri dhe niveli i zhurmës në kabinën është mjaft i ulët. Por kapaku i kapakut mbështetet në vulat prej gome me shkumë, të cilat për disa muaj thjesht do të shndërrohen në pluhur.Прандаж, нэ вендин и тире ду тэ дуэ тэ тэ вендосни гоме (нэ нджэ мэнырэ осэ нэ нджэ тджетэр).

Një hodgepodge e parafabrikuar e njësive të besueshme dhe të testuara me kohë arriti në tregun rus.

Një tjetër pengesë në ndarjen e motorit është se është mjaft e vështirë për të arritur në filterrin e ajrit, tubat ndërhyjnë. Сигуришт, ато мунд тэ дженэ тэ перкулура осе тэ ндара, пор кжо сьелль диса шкетэсимэ штесэ.

Salloni dhe elektronika

Дизайн и брендшэм мир ти атрибутирует плотэсишт минимализм.Por kjo është pak më ndryshe nga minimalizmi që është e natyrshme në prodhuesit e tjerë kinezë. Megjithëse materialet më buxhetore janë përdorur për dekorimin e brendshëm, ajo duket mjaft e paraqitshme. Дхе мэ рендэсишмджа, брендэсия и саллонит нук до тэ бэхет э мерзитшме эдхе пас диса витеш — тхешт нук ка асгджэ пэр ту берэ тэ мерзитшме атдже.

Shkurtimisht në lidhje me pro dhe kundër

Një plus и caktuar i sallonit:

• Хапешира: седильджа э пасме мунд тэ стреходжа рехат тре персона 180 э мэ шумэ;
• Të gjithë elementët janë të menduar mirë dhe ergonomik;
• Не консолен qendrore тэ компьютерит нэ борд, джу мунд тэ гджени тэ дхена интересанте нэ лидже ме макинен дхе, пэрвеш кешай, кохен, датэн дхе тэ нгджашме;
• Origjina kineze e makinës në dizajnin e brendshëm të kujton futjen me timon me shkëlqim, shumë e spikatur për modelet perëndimore.Сидокофте, në përgjithësi, salloni është bërë në një mënyrë perëndimore.

Саллон и букур, лаконик.

Përshtypja mund të prishet nga fakti që sediljet janë të veshura me pëlhurë dhe pjesët anësore janë shumë të buta.
Në çdo konfigurim, makina ka një sistem multimedial me kontroll të ekranit prekës, i cili në thelb është një tabletë 6.5 дюймов. Me të mund të përdorni të dy disqet flash dhe disqet, përdorni sistemin Handsfree. Сети и плотэ ка нджэ сенсор парки кэ шфак имажин е камерас сэ пасме нэ таблетка дхе Bluetooth штуар пэр нджэ комодитет тэ персосур.

Tingulli del në 4 altoparlantë, cilësia e të cilave mund t’i përshtatet shumicës së automjeteve. Muzikantët dhe njohësit e tingullit krejtësisht të qartë mund të mos jenë plotësisht të kënaqur.
Por kondicioneri dhe 4 çantat e ajrit, me siguri, do t’u pëlqejnë të gjithëve.

Тест-драйв: në qytet dhe jashtë rrugës

E rëndësishme! Макина дефинитивишт нук është krijuar për të pushtuar jashtë rrugës në male ose pyje të pakalueshme. Por është perfekt për rrugët problematike në Rusi.

Kinezët e mblodhën atë në bazë të një platforme të krijuar nga francezët nga shqetësimi PSA dhe e përshtatën posaçërisht për kushtet e Rusisë. Пёр кэтэ, пэр трре вджет, моделили экспериментальный ка удхэтуар пёргджатэ гропаве дхе копезаве тэ ругэве тона, герцог е берэ атэ тэ рехатшме пэр тэ удхэтуар нэ нджэ даштэ кджэ нджэ даштэ кджо джэпазник, нджэ дашит нджэ нджэ дашитэ ржэджитэ ржэджитэ рэгэджэ тэ нджэ дзэпик.

h40 Cross ka vetëm 2 pedale në vend të 3 të zakonshmet, gjë që është shumë e përshtatshme për të kapërcyer bllokimet e trafikut në zonat metropolitane.

Меррет përshtypja се макина është krijuar për një udhëtim të qetë dhe të saktë. Кур shtypni pedalet e gazit ose frenave, ajo përgjigjet pa проблема, pa kërcime të papritura. Në rastin e parë, ky është një plus i caktuar, por e dyta do të duhet të përshtatet.

Пер та хекур тимонин нга кичи нэ кич, до тэ духет та ктхени атэ 3.7 херэ — ктешат э мпрехта гджиташту до тэ дэштойнэ.

Çmimi i emetimit

Avantazhi kryesor i Downfeng është çmimi i tyre.Megjithëse këto SUV quhen parket, çmimi i Tire është i krahasueshëm me hatchback-et evropiane të buxhetit. Сот, çmimi mesatar i një makine të tillë është 75 800 juan, që është afërsisht e barabartë me 446 000 руб.

Герцог Маррэ парасиш që treguesit e sigurisë për makinat kineze janë rritur ndjeshëm vitet e fundit, atëherë blerja do të jetë përfundimisht fitimprurëse.

Видео: Мнение në lidhje me DongFeng h40

Një tjetër kompani kineze hyri në tregun rus — në fund të prillit, Dongfeng gjithashtu prezantoi hatchback-un h40 Cross të gjithë terrenit.Të dy janë ndërtuar në të njëjtën bazë, por në të njëjtën kohë ata kanë shumë ndryshime midis tyre.

Sigurisht, Dongfeng h40 Cross 2018-2019 (foto, çmimi) është pak më i shkurtër se me katër dyer — gjatësia e përgjithshme e hatchback është 4 351 мм, por në të më njëjtën isohëjtën könen e lartë (1,528) se седан. Baza e rrotave të të dy modeleve është 2,610 milimetra, dhe vëllimi i bagazhit të çelësit është 417 литров.

Konfigurimet dhe çmimet e Dongfeng h40 Cross 2019.

MT5 — механика меня 5 шпэйтёси, AT4 — автоматика меня 4 шпэйтёси.

Jashtë, Dongfeng N30 Cross dallon jo vetëm me një komplet mbrojtës plastic të trupit rreth perimetrit të trupit, por në të njëjtën kohë ka një grilë radiatori dhe parakolpëmë nedryshan. Плюс, një makinë e Tillë mburret me një pastrim toke të rritur me 25 mm dhe binarët e çatisë.

Пэр мэ тепэр, хэтчбек-у и тэ гджитэ терренит ëште я диспонуешем меня макинэ опционале меня тэ гджита рротат, гджэ кэ и джеп асадж диса пикэ крахасуар ме моделет э нгджашме тэ закизэпле конкурренчэплэ конкурренчэплэ конкурренчэд ngritur nga toka (dhe madje edhe jo gjithmonë).

На этой платформе появилась новая платформа Citroen ZX. Megjithëse është modernizuar, kontrollueshmëria e modelit mund të rezultojë më e keqe se ajo e shokëve të klasës më moderne. Por kjo qasje e dizajnit përdoret nga shumica e prodhuesve kinezë.

DFM h40 Cross (характеристика) drejtohet nga një motor benzinë ​​1,6 литра мне 117 kuaj fuqi. Mund të çiftëzohet me një transmetim manual me pesë shpejtësi ose të çiftëzohet me një Aisin automatik me 4 rreze.

mimi i Dongfeng h40 Cross 2019, мне нужно 649000 рублей (44000 рублей за седан). Pajisja standarde e modelit përfshin jastëkët e përparmë dhe anësorë, ABS, dritaret e energjisë në të gjitha dritaret, pasqyrat elektrike me pamje të pasme dhe një sistem audio standard me 4 altoparlantë. Версии меня трансметим автоматик влересохет на 709 000 руб.

Dong Feng N30 Cross duket shumë mbresëlënëse! Dizajni i tij integron me shkathtësi si elementë jashtë rrugës ashtu edhe elementë sportivë.Ekziston një grilë radiatori i rafinuar me vrima, që shkëlqen me krom, një komplet trupi plastik praktik dhe mashkullor rreth perimetrit, një spoiler i pasëm. Fenerët — оригинальная форма «fajko» me LED të ndritshme. Optika и pasme gjithashtu ka element LED. Makina mund të blihet në pesë ngjyra të trupit — nga argjendi klasik tek e kuqja tërheqëse.

Makina është e pajisur me një motor me katër cilindra 1,6 литра që prodhon 117 kf. Шпейтэсия максимале ште 183 км / орэ.Njësia e energjisë plotësohet nga një kuti ingranazhesh manuale ose automatike. Kjo e fundit meriton vëmendje të veçantë — ky është një, модель меня, katër faza nga kompania japoneze Aisin. Isshtë e pajisur me një funksion të zgjedhjes manuale të marsheve, si dhe mënyrave sportive dhe dimërore, të cilat ju lejojnë të përshtatni «характер» e udhëtimit në preferencat e udhëtimit në preferencat e.

Salloni ju përshëndet me materiale me cilësi të lartë dhe dizajn ergonomik.Ajo përmban zbukurime druri në llak Piano Black, lëkurë makine premium dhe veshje kromi. Paneli përdor gjithashtu futje të fibrave të karbonit. Në pjesën qendrore të tij ekziston një kompjuter në bord, në ekranin e të cilit, kur kthehet prapa, shfaqet distanca deri në pengesë.

Prodhuesi pak i njohur kinez DongFeng Motor Corporation përfaqësohet në tregun rus nga disa model. Njëri prej tyre, Dongfeng h40 Cross, u prezantua jo shumë kohë më parë. Makina është stilizuar pak si një crossover, edhe pse mund të quhet një shtrirje e Tillë.Ky artikull është një arsye e shkëlqyeshme për të parë nga afër «кинезет», për të parë tek ai të paktën një aluzion suksesi në drejtim të pushtimit të zemrave ruse. E gjithë formacioni я DongFeng.

E jashtme

Për sa i përket kontureve të tij, псевдо-kryqëzimi DongFeng është shumë i ngjashëm me sedan S30, por ka një komplet Plastik të trupit dhe pastur një. Grilë e rreme e radiatorit u ndryshua, dhe parakolpët dhe pjesa e pasme e trupit ishin të ndryshme.Binarët e çatisë u shfaqën në çatinë e Dong Feng Cross dhe aty ishte një спойлер. Megjithatë, kjo makinë është ende larg një crossover të plotë. Kryqi Dongfeng h40 mbrohet rreth perimetrit nga një mbrojtës plastic, i cili gjithashtu mbron parakolpët e përparmë dhe të pasmë. Fotot kryq Dongfeng h40 tregojnë se pavarësisht nga të gjitha nuancat, makina është mjaft e këndshme. Sipas rishikimeve, pjesa e pasme i jep makinës tërheqjen më të madhe; аджо стрехон капакун е песте тэ багажит меня нджэ готэ тэ вогэл дхэ нджэ спойлер тэ фукишэм.Dizajni i hijshëm plotësohet në mënyrë të përsosur nga grilë radiatori, e cila, në kombinim me parakolpin, i jep makinës një stil dhe dinamikë unike.

Dimensionet e automjetit janë si më poshtë:

• Gjatësia 4336 мм;
• Gjerësia 1760 мм;
• Lartësia 1528 мм;
• Базовый ротор 2610 мм;
• Пастрими 175 мм;
• Masa e makinës është 1230–1250 кг.

Brendshme

Gjëja e parë për të cilën shoferi do të kthehet gjatë provës së DongFeng h40 Cross është konfigurimi me pesë vende të sed makinës dhe pjesa ejëga brendshme pörsean ejsean ejsean njsean pöshme.Për fat të keq, në dekorimin e risisë, u përdor plastika me një pëlhurë, конкретно në dukje dhe erë. Por paneli i përparmë është mjaft и bukur. Ка эргономи тэ шкэлкйешме дхэ хапэсирэ лирэ, е цила штэ э мьяфтуешме пэр пасагйерэт ме потхуаже чдо лартэси дхе пеше. Ndoshta ndryshimi kryesor nga sedan është kapaciteti më i vogël i hapësirës së bagazhit. Me ulëset ulur poshtë, 1137 литра нгаркесэ мунд тэ хидхен нэ тэ, dhe në gjendjen normale — 417 литров. Në përgjithësi, pjesa e brendshme e makinës është klasike dhe nuk shkakton tjetërsim.Седилджет джанэ тэ мбулуара ме пэлхурэ ме чилэси тэ лартэ, тэ чилэн продхуеси тхухет се до та тестоджэ нэ куште мьяфт тэ вештира. Paneli është информирует dhe ofron të gjitha informacionet e nevojshme për gjendjen teknike të makinës gjatë ngasjes. Макина është e pajisur me një qendër të pavarur multimediale me kontroll prekës, vlen të përmendet se Rusifikimi është në një nivel me cilësi të lartë.

Cirilika shfaqet si duhet. Sidoqoftë, sistemi audio i makinës kineze lë për të dëshiruar. Sediljet kryq DongFeng h40 rregullohen manualisht në gjashtë drejtime të ndryshme.Нджэ типар даллуес и кетий продхуэси нга Мбретэрия е Месме është се аи паджиси нджэ кути тэ вечанте пер сызет нэ дорен е маджте тэ шоферит. Në varësi të pajisjes, automjeti do të pajiset me funksione të ndryshme. Герцог куптуар që макина до тэ шкойэ крисишт ветэм нэ трегун европиан, Донгфенг штои нэ тэ нджэ таволл дхе нджэ чакмак сигарет, гджэ që штэ нджэ лайм и мирэ пер пинбилистэт. Për komoditet dhe komoditet maksimal të shoferit, konfigurimi i nivelit të lartë ka një kamerë me pamje të pasme.

Në përgjithësi, salloni është i rehatshëm dhe i gjerë. Mund të jeni i sigurt se edhe pesë njerëzit jo më të hollë mund të përshtaten rehat në të. Rezerva е hapësirës së lirë për mbështetëset e përparme nga sedilja e pasme për një person me një lartësi prej rreth 185 cm është më shumë se pesë сантиметра. Brendësia moderne, lokalizimi rus, montimi me cilësi të lartë dhe butonat e rregullt — kjo nuk është lista e plotë e asaj me të cilën është e pajisur DongFeng h40 Cross. Нга Rruga, kompjuteri në борды еште shumë informues, në të Mund të merrni Informacion në lidhje меня Коген, DATEN, konsumin е karburantit, rezervën е energjisë ДНЕ shumë tregues të tjerë ро водн të rëndësishëm të gjendjes С.Е. automjetit.

Минус и саллонит, мунд тэ даллохен на вид:

1. Plastikë me cilësi të ulët. Туште шумэ э вештирэ;
2. Tapiceri të ulur të ndenjëseve.

Sidoqoftë, në përgjithësi, pjesa e brendshme është e mirë dhe ndryshe nga makinat e zakonshme kineze. Në konfigurimin e nivelit të lartë, shoferi do të jetë në gjendje të vlerësojë sistemin e tij multimedial me mbështetje për të gjitha formatet muzikore të njohura dhe leximin nga USB, CD.Në versionin rehati, i njëjti sistem ndodhet në kabinën, por me një ekran më të vogël.

Specifikimet

Pavarësisht nga tregu, DongFeng h40 Cross është i pajisur me vetëm një motor me aftësi shumë Modete. Po flasim për një motor 1,6 литрш, me katër cilindra, me 16 valvola me një funksion injeksioni karburanti me shumë pika. 117 л.с. A është gjithçka që mund të prisni nga motori pseudo-kryqëzues Dong Feng. Më vjen mirë që konsumi i karburantit në ciklin e kombinuar nuk i kalon 7 литров.Karakteristikat teknike të DongFeng h40 Cross janë në përputhje me trendet aktuale në industrial e automotivebilave. Sistemi i kontrollit të timonit meriton vëmendje të veçantë, është i pajisur me një përforcues elektrik. Një zgjidhje e ngjashme është duke u instaluar në makinat kryesore premium. ESP kursen karburant gjatë ngasjes dhe zvogëlon emetimet e dëmshme në mjedis krahasuar me një drejtues klasik të energjisë. Në të njëjtën kohë, gjatë ngasjes, drejtimi kontrollohet më mirë dhe i përgjigjet çdo lëvizjeje.Falë kësaj, është e mundur të arrihet qëndrueshmëri dhe trajtim i rehatshëm gjatë ngasjes.

DongFeng h40 Cross miraton kutinë e shpejtësisë automatike Aisin nga prodhuesi i famshëm japonez, mbështet zgjedhjen manuale të ingranazheve, është i besueshëm dhe i lehtë për tur’u. Gjithashtu zvogëlon konsumin e karburantit krahasuar me analogët. Мотори A16 и pёrdorur plotësohet me teknologjinë VVT — ju lejon të rregulloni kohën e valvulës. Мотори плотсон тэ гджита стандартет европиан дхе штэ мьяфт и фукишэм, я бесуешэм меня нджэ резервэ тэ мадхе тэ энергджисэ.Emetimi i ulët i gazrave të dëmshëm të shkarkimit plotëson kërkesat e sigurisë. Duke kombinuar kutitë e shpejtësisë Aisin siç janë Peugeot 308 2014 dhe suvux Luxgen7, dhe këtë motor, ai arrin një udhëtim të shkëlqyeshëm dhe Potencialin e plotë të DongFeng. Gjatë viteve të kaluara, ekspertë nga DongFeng kane kryer shumë studime mbi besueshmërinë dhe ekonominë e motorit. Ай и юстификой плотэсишт шпресат që ишин дхенэ. Për Federatën Ruse, компания ka përshtatur posaçërisht pezullimin dhe motorin në mënyrë që të arrijë efikasitetin maksimal.

DongFeng h40 крест është i kënaqur të ofrojë një kombinim të stilit dhe teknologjisë. Makina mbështet ABS + EBD, është e pajisur me një paketë të plotë elektrike, katër jastëkë ajri dhe një sistem të plotë multimedial. Pezullimi i pjesës së përparme të makinës është i pavarur me shirita kundër rrotullimit, dhe pjesa e pasme me krahë zvarritës. Pezullimin mund ta shërbeni vetë, nuk ndryshon nga modelet e njohura të sedanëve evropianë. Shpejtësia maksimale që mund të arrihet në kryqin h40 është rreth 183 kilometra në orë.

DongFeng h40 Cross Safety

Siguria e DongFeng h40 Cross është në një nivel të mirë, siç dëshmohet nga shumë funksione me të cilat është e pajisur makina:

jontemalls автомджетит гджатэ френимит тэ форте;
• Подушка безопасности Katër для shoferin dhe pasagjerin në rreshtin e parë. Ды предж тире джанэ тэ вендосура нэ анэт, дхэ тэ тджерэт нэ пьесэн и перпарме;
• Në rast të një goditje të fortë balre, rripat e sigurimit do të veprojnë në nivelin më të lartë, ато sigurojnë фиксим të besueshëm të shoferit dhe pasagjerit pasi atojanë tésé pésagjerit pasi ato janë të;
• Bllokimi i fëmijëve është një mbrojtje e besueshme kundër hapjes së dyerve nga fëmijët gjatë ngasjes;
• Mbështetje për sediljet për fëmijë ISOFIX;
• Parktronic — një sistem që informon për afrimin ndaj pengesave gjatë parkimit;
• Иммобилайзер — nuk lejon fillimin e makinës me një çelës tjetër, mundësia e vjedhjes së makinës zvogëlohet në zero;
• Sistemi Tai Chi siguron mbrojtje të besueshme për të gjithë njerëzit në makinë, e cila është e përforcuar me trarë të veçantë rreth perimetrit;
• Pjesa e përparme e makinës është e pajisur me zona të veçanta që zbusin ndikimin kur makina përplaset me një këmbësor;
• Sistemi i kontrollit të ndikimit ju lejon të zhbllokoni dyert në të gjithë makinën në rast aksidenti, dyert do të hapen automatikisht.Gjithashtu, rrjedha e karburantit në motor do të ndërpritet pothuajse menjëherë për të parandaluar ndezjen e automjetit.

Opsionet dhe çmimet

Kur blini një DongFeng h40 Cross, përdoruesi mund të llogarisë në praninë e një bllokimi qendror për sigurinë e makinës, dritat e mjegullaerajës, pårdoruesi mund të llogarisë në praninë e një bllokimi qendror për sigurinë e makinës, dritat e mjecrojörëë çanta ajri dhe një kompleks multimedial me një 6.5 inç shfaqje. Kostoja e hatchback kinez fillon me 579000 руб.

Pro dhe kundër të Dong Feng N30 Cross

Përparësitë e DongFeng h40 Cross janë:

1. Konsumi i ulët i karburantit;
2. Pamje e bukur;
3. Disponueshmëria e të gjitha sistemeve moderne të sigurisë;
4. Përmirësimi i trajtimit dhe manovrimit;
5. Калуешмера;
6. Rregullimi i timonit jo vetëm në lartësi, por edhe në arritje;
7. Пастрими и мирэ и токес.

Disavantazhet përfshijnë:

• Mungesa e sediljeve dhe pasqyrave të nxehta;
• Pezullim jo shumë i lartë i cilësisë;
• Изолим и добет и зерит;
• Mungesa e dyshekëve të gomës së makinave.

Në përgjithësi, duhet thënë se DongFeng h40 Cross është më и përshtatshmi për ngasje komode nëpër qytet ose në autostradë. Нэ куштет джаштэ рругес, нук штэ э фортэ. Pezullimi jo i përshtatur për rrugët ruse ju bën të ndiheni vazhdimisht të pakëndshëm kur kaloni pranë policëve të gënjyer ose kur makina futet në një vrimë në rrugë. Ндошта Донгфенг до тэ джетэ нэ гджендже тэ фитоджэ нджэ террен нэ трегун рус, пор пара сэ гджиташ, компания духет тэ элеминоджэ мангеситэ и першкруара нэ артикулл, паси që конкуррент тэджитэ парашу тэ мэджитэ мэджитэ мэджитэ мэджитэ мэджитэ мэджитэ парасионал.

Përmbledhur

Pas një makine provë të vogël të DongFeng Cross h40, bëhet e qartë se makina kineze është e shkëlqyeshme për të ecur shpejt në rrugë të mira. Пор тэ калош нэпэр бллокиме тэ трафикут осэ, эдхэ ме кек, тэ нгджитеш нэ шпате тэ бута штэ мэ мирэ пэр дичка мэ сериозе. Për udhëtime të pёrditshme, makinës së shkrimit i mungon pak rehati. Sipas pronarëve të Dong Feng Cross, makina ka проблема меня pezullimin dhe elektronikën e shërbimit.