186 регион это: 86 и 186 регион — это какой город России

86, 186 регион — какой город или область

86, 186 регион — это Ханты-Мансийский автономный округ (Югра) в России.

86, 186 регион на автомобильных номерах машины

Код региона регистрации на номерах авто: 86, 186.

Код на номерах машин до 1993 года: ТЮ, ТМ.

Столица	Ханты-Мансийск
Площадь	534 801 км²
Население	1 688 378 человек
Федеральный округ	Уральский
Расстояние до Москвы	1 900 км по прямой
Часовой пояс	MSK+2 (UTC+5)
Код ОКАТО	71
Экономический район	Западно-Сибирский

Степень автомобилизации (количество авто на 1 000 человек населения): 365. У каждого третьего жителя региона есть машина.

86, 186 код на номерах авто.

Качество трассы в регионе

Качество дорог в Ханты-Мансийском автономном округе — хорошее, по сравнению со Свердловской областью и Республикой Коми.

Нет, с ними все плохо

68.18%

Проголосовало: 22

Соседние регионы

С Ханты-Мансийским автономным округом (86, 186) граничат следующие субъекты РФ:

Описание региона

В качестве административно-территориальной единицы Ханты-Мансийский автономный округ образован в 1978 году. Координаты — 61°0′ с. ш. 69°0′ в. д.

Код округа: +7 346

Время в регионе сейчас онлайн	Географическое положение
	UTC +5, GMT+5
Часовой пояс по IANA: Asia/Yekaterinburg

Геральдический символ Ханты-Мансийского автономного округа – это сине-зеленый щит, на котором изображена мифическая птица  «Кат ухуп вой» с двумя головами и четырьмя лапами. Элемент держат медведи со знаменами. Звери стоят на подножии из еловых и кедровых ветвей. У основания щита находится лазоревая лента, на которой написано: «ДЕЛАМИ ВЕЛИКАЯ». Сверху элемент декорирован короной.

Флаг региона — это прямоугольная материя, которая по горизонтали разграничена на несколько цветовых зон (ярко-голубая и зеленая). В левой  части знамени (вверху) находится белый фрагмент герба автономного округа.

Герб	Флаг

Климат — резко континентальный. Короткое лето чередуется со студеной и продолжительной зимой. Средняя годовая температура воздуха — (+0,5°С).

Таблица — Климатограмма региона по году

Погода сейчас в Ханты-Мансийском автономном округе.

86, 186 регион на карте России.

Коды регионов на автомобильных номерах (обновлённый список 2020 года)

Цифровые коды регионов от «01» до «89» изначально присвоили по списку субъектов федерации, перечисленных в Конституции. Уже в 1999 году для Москвы пришлось вводить новый код «99», позднее дополнительные коды получили многие другие регионы, а в 2004 году на номерах появились трёхзначные коды.

В 2019 году и в начале 2020 года номера с новыми кодами начали выдавать в Башкортостане, Москве, Алтайском и Краснодарском краях, Ленинградской, Ростовской, Московской, Оренбургской и Челябинской областях. Теперь таблица с кодами регионов России выглядит так.

01	Республика Адыгея
02	Республика Башкортостан
03	Республика Бурятия
04	Республика Алтай
05	Республика Дагестан
06	Республика Ингушетия
07	Кабардино-Балкарская Республика
08	Республика Калмыкия
09	Карачаево-Черкесская Республика
10	Республика Карелия
11	Республика Коми
12	Республика Марий-Эл
13	Республика Мордовия
14	Республика Саха-Якутия
15	Республика Северная Осетия-Алания
16	Республика Татарстан
17	Республика Тува
18	Удмуртская Республика
19	Республика Хакасия
20	Чеченская Республика	В 2000 году все номера заменили на новые с кодом 95
21	Чувашская Республика
22	Алтайский край
23	Краснодарский край
24	Красноярский край
25	Приморский край
26	Ставропольский край
27	Хабаровский край
28	Амурская область
29	Архангельская область
30	Астраханская область
31	Белгородская область
32	Брянская область
33	Владимирская область
34	Волгоградская область
35	Вологодская область
36	Воронежская область
37	Ивановская область
38	Иркутская область
39	Калининградская область
40	Калужская область
41	Камчатский край	до 2007 года — Камчатская область
42	Кемеровская область
43	Кировская область
44	Костромская область
45	Курганская область
46	Курская область
47	Ленинградская область
48	Липецкая область
49	Магаданская область
50	Московская область
51	Мурманская область
52	Нижегородская область
53	Новгородская область
54	Новосибирская область
55	Омская область
56	Оренбургская область
57	Орловская область
58	Пензенская область
59	Пермский край	до 2005 года — Пермская область
60	Псковская область
61	Ростовская область
62	Рязанская область
63	Самарская область
64	Саратовская область
65	Сахалинская область
66	Свердловская область
67	Смоленская область
68	Тамбовская область
69	Тверская область
70	Томская область
71	Тульская область
72	Тюменская область
73	Ульяновская область
74	Челябинская область
75	Забайкальский край	до 2008 года — Читинская область
76	Ярославская область
77	Москва
78	Санкт-Петербург
79	Еврейская автономная область
80	бывший Агинский Бурятский автономный округ	с 2008 года в составе Забайкальского края
81	бывший Коми-Пермяцкий автономный округ	с 2005 года в составе Пермского края
82	Республика Крым	с 2014 года, до 2007 года номера выдавались в Корякском автономном округе
83	Ненецкий автономный округ
84	бывший Таймырский автономный округ	с 2007 года в составе Красноярского края
85	бывший Усть-Ордынский Бурятский автономный округ	с 2008 года в составе Иркутской области
86	Ханты-Мансийский автономный округ
87	Чукотский автономный округ
88	бывший Эвенкийский автономный округ	с 2007 года в составе Красноярского края
89	Ямало-Ненецкий автономный округ
90	Московская область	с 2001 года
91	Калининградская область	код используется только на экспортных транзитных номерах
92	Севастополь	с 2014 года
93	Краснодарский край	с 2005 года
94	Байконур	территории, находящиеся за пределами РФ
95	Чеченская республика	с 2000 года
96	Свердловская область	с 2006 года
97	Москва	с 2002 года
98	Санкт-Петербург	с 2004 года
99	Москва	с 1998 года
102	Республика Башкортостан	с 2006 года
113	Республика Мордовия	с 2009 года
116	Республика Татарстан	с 2006 года
121	Чувашская Республика	с 2008 года
122	Алтайский край	с 2019 года
123	Краснодарский край	с 2011 года
124	Красноярский край	с 2009 года
125	Приморский край	с 2005 года
126	Ставропольский край	с 2013 года
134	Волгоградская область	с 2012 года
136	Воронежская область	с 2010 года
138	Иркутская область	с 2013 года
142	Кемеровская область	с 2011 года
147	Ленинградская область	с 2019 года
150	Московская область	с 2006 года
152	Нижегородская область	с 2009 года
154	Новосибирская область	с 2010 года
156	Оренбургская область	с 2020 года
159	Пермский край	с 2007 года
161	Ростовская область	с 2007 года
163	Самарская область	с 2006 года
164	Саратовская область	с 2005 года
173	Ульяновская область	с 2007 года
174	Челябинская область	с 2007 года
177	Москва	с 2005 года
178	Санкт-Петербург	с 2010 года
186	Ханты-Мансийский автономный округ	с 2012 года
190	Московская область	с 2009 года
193	Краснодарский край	с 2019 года
196	Свердловская область	с 2013 года
197	Москва	с 2010 года
198	Санкт-Петербург	с 2018 года
199	Москва	с 2007 года
702	Республика Башкортостан	с 2019 года
750	Московская область	с 2013 года
716	Республика Татарстан	с 2017 года
761	Ростовская область	с 2019 года
763	Самарская область	с 2017 года
774	Челябинская область	с 2020 года
777	Москва	с 2013 года
790	Московская область	с 2020 года
797	Москва	с 2020 года
799	Москва	с 2017 года

86, 186 — коды какого региона? Узнай здесь!

В нашей огромной стране существуют 86 регионов, и у каждого из них есть своё цифровое обозначение на автомобильном номере. Конечно же, довольно трудно запомнить их все, и при встрече с очередным значением, не представляется возможным узнать, из какого же субъекта РФ приехал этот автомобиль. Подробный ответ вы найдёте на этой странице.

Большинство регистрационных знаков — стандартные знаки образца 1993 года, вид которых определён ГОСТ Р 50577-93 (приказ от 30 июля 1993 года № 362 о новых государственных регистрационных знаках транспортных средств).

Изначально в качестве кодов регионов применялись только числа от 01 до 89, по количеству регионов РФ на 1 января 1993 года. Однако количество регистрируемых автомобилей с каждым годом увеличивается, и номерных знаков с допустимыми комбинациями начинает не хватать. По этой причине в ряде субъектов России введены дополнительные кодовые обозначения, которые можно использовать на знаках; сначала началась выдача кодов регионов от 90 до 99 (кроме кода 92, который впоследствии был задействован в Севастополе), а затем перешли к трёхзначным кодам регионов. Для трёхзначных кодов в качестве первой цифры сначала разрешалось использовать только единицу, с 2013 года — 1 и 7, а с лета 2020 года — любую цифру, кроме нуля.

86, 186 — коды на номерах Ханты-Мансийского автономного округа Югра

Административный центр: Ханты-Мансийск

Федеральный округ: Уральский

Экономический район: Западно-Сибирский

Часовой пояс: МСК+2

Дата образования: 10 декабря 1930 года

Площадь: 534 801 км² (9 место в РФ)

Население: 1 674 676 чел (2020) (29 место в РФ)

Кликни на ручку и попробуй получить красивый номер =)

Ханты-Мансийский автономный округ — 186 регион. Краткий обзор

Приехав в Югру, каждый турист мечтает посетить уникальные природные памятники, знаменитые на всю Россию. Югра – историческое название Ханты-Мансийского автономного округа, который также известен как 186 регион.

Столицей, или административным центром, является Ханты-Мансийск. Он, как и весь регион, входит в Уральский федеральный округ. Площадь региона составляет 534,8 тысяч кв. км. На территории ХМАО проживает 1,6 миллиона человек.

186 регион России, т. е. ХМАО, расположился в срединной части страны. Центральная часть Западно-Сибирской равнины приходится именно на эту область. На территории округа находятся возвышенности, низины, низменности. В уральской части можно наблюдать среднегорный рельеф. Максимальными высотами являются:

По территории округа протекают Иртыш, Обь, 12 притоков крупных рек и множество мелких ручьев. Их общее количество составляет порядка 30 тысяч.

Животный и растительный миры могут похвастаться своим разнообразием. В зависимости от территории, представители флоры и фауны могут варьироваться.

ХМАО является лидером по многим показателям среди остальных субъектов РФ:

• I место – объем промышленного производства;
• I место – добыча нефти;
• I место – производство электроэнергии;
• II место – добыча газа;
• II место – поступление налогов в бюджетную систему;
• II место – объем инвестиций в основной капитал.

Административное деление

На территории округа насчитывается 106 муниципальных образований. Также ХМАО разделен на 13 городских округов:

• Когалым.
• Нефтеюганск.
• Пыть-Ях.
• Нижневартовск.
• Нягань.
• Урай.
• Лангепас.
• Сургут.
• Ханты-Мансийск.
• Югорск.
• Покачи.
• Радужный.
• Мегион.

186 регион делится на 9 муниципальных районов: Березовский, Кондинский, Сургутский, Нефтеюганский, Белоярский, Советский, Нижневартовский, Октябрьский, Ханты-Мансийский.

История показывает, что с начала 20 века округ входил в различные области:

• 17.01.1934 – Обь-Иртышская область;
• 07.12.1934 – Омская;
• 04.07.1937 – Ямало-Ненецкий национальный округ;
• 14.08.1944 – Тюменская область.

Транспорт и логистика

186 регион довольно развит в транспортной сфере. Так, на территории округа насчитывается 8 аэропортов и 3 речных порта.

Аэроузлы находятся в Ханты-Мансийске, Белоярске, Нягани, Кондинском, Когалыме, Урае, Советском районе и Березово.

Речные порты: Сергинский, Нижневартовский, Сургутский.

Достопримечательности ХМАО

Среди всех достопримечательностей особую нишу заполняют природные памятники. 186 регион насчитывает 8 уникальных заповедников, которые находятся под защитой государства. Естественно, они открыты для туристов. Но основная цель – все-таки сохранить первозданный вид.

• Остров Овечий находится в Нижневартовском районе (защита уникальной природной экологической системы).
• Ханты-Мансийские холмы расположились в окрестностях столицы. Открыты для туризма и рекреации.
• Лесоболотная зона «Большое Каюково» в Сургутском районе. На территории этого памятника природы сохранились основные виды болот и лесов, характерных для Западной Сибири.
• Шапшинские кедровники расположились в Ханты-Мансийском районе. Здесь сохраняются естественные ландшафты, богатые кедровыми насаждениями.
• Остров Смольный – гордость Нижневартовского района, где сохраняется уникальная природная экосистема.
• Чеускинские кедровники расположились в Нефтеюганском районе. Этому памятнику природы присвоено санаторное и рекреационное значение.
• Озеро Ранге-Тур славится особенной экосистемой: на побережье расположены массивы сфагновых болот, светлые сосновые боры, места гнездования орлана-белохвоста.
• Система озер Ай-Новыинклор, Ун-Новыинклор расположилась в Белоярском районе. Здесь защищается и изучается уникальный комплекс озер.

Итак, если интересует вопрос: «186 – какой регион?», то ответ однозначный: это Ханты-Мансийский автономный округ, славящийся своими природными памятниками. Туристам будет интересно посетить исторические и заповедные места, насладиться сочетанием городской жизни и дыхания природы.

86 и 186 регион

Ниже представлен полный перечень автомобильных кодов регионов России.

Коды ГИБДД регионов России состоят из 2-х и 3-х значных чисел, на конец 2021 — начало 2021 года насчитывается 139 кодов для 86 территориальных субъектов РФ, включая дополнительные региональные и ограниченные коды. Стандарт номерных знаков транспортных средств действует в Российской Федерации с 1 Января 1994 года.

В таблице имеется удобный поиск по регионам.

Площадь ХМАО: 534 800 км²

Округ является экономически регионом Западной Сибири. Это основной нефтегазодобывающий район России, относящий к крупным нефтедобывающим регионов мира. Ханты-Мансийский автономный округ был образован постановлением ВЦИК от 10 декабря 1930 года «Об организации национальных объединений в районах расселения малых народностей Севера» и входил в Уральскую область. Первое название региона – Остяко-Вогульский национальный округ.

Коды регионов России

Телефонные коды

Приложение № 1 к Требованиям к оформлению документов, представляемых в регистрирующий орган

Согласно ст. 65 Конституции РФ в составе Российской Федерации находятся следующие субъекты Российской Федерации:

Наименование субъекта РФ	Код субъекта	Код ГИБДД-ГАИ (автомобильные номера)	Код ОКАТО и ОКТМО	Код ISO 3166-2 и ГОСТ 7.67-2003
Республика Адыгея	01	01	79	RU-AD
Республика Алтай	04	04	84	RU-AL
Республика Башкортостан — Башкирия	02	02, 102, 702	80	RU-BA
Республика Бурятия	03	03	81	RU-BU
Республика Дагестан	05	05	82	RU-DA
Республика Ингушетия	06	06	26	RU-IN
Кабардино-Балкарская республика	07	07	83	RU-KB
Республика Калмыкия	08	08	85	RU-KL
Карачаево-Черкесская республика	09	09	91	RU-KC
Республика Карелия	10	10	86	RU-KR
Республика Коми	11	11, 111	87	RU-KO
Республика Крым	91	82	35	RU-CR
Республика Марий Эл	12	12	88	RU-ME
Республика Мордовия	13	13, 113	89	RU-MO
Республика Саха (Якутия)	14	14	98	RU-SA
Республика Северная Осетия — Алания	15	15	90	RU-SE
Республика Татарстан — Татария	16	16, 116, 716	92	RU-TA
Республика Тыва	17	17	93	RU-TY
Удмуртская республика — Удмуртия	18	18	94	RU-UD
Республика Хакасия	19	19	95	RU-KK
Чеченская республика — Чечня	20	95, 995	96	RU-CE
Чувашская республика	21	21, 121	97	RU-CU
Алтайский край	22	22, 122	01	RU-ALT
Забайкальский край	75	75, 80	76	RU-ZAB
Камчатский край	41	41	30	RU-KAM
Краснодарский край	23	23, 93, 123, 193	03	RU-KDA
Красноярский край	24	24, 124, 84, 88	04	RU-KYA
Пермский край	59	59, 81, 159	57	RU-PER
Приморский край	25	25, 125	05	RU-PRI
Ставропольский край	26	26, 126	07	RU-STA
Хабаровский край	27	27	08	RU-KHA
Амурская область	28	28	10	RU-AMU
Архангельская область	29	29	11	RU-ARK
Астраханская область	30	30, 330	12	RU-AST
Белгородская область	31	31	14	RU-BEL
Брянская область	32	32	15	RU-BRY
Владимирская область	33	33, 333	17	RU-VLA
Волгоградская область	34	34, 134	18	RU-VGG
Вологодская область	35	35	19	RU-VLG
Воронежская область	36	36, 136	20	RU-VOR
Ивановская область	37	37	24	RU-IVA
Иркутская область	38	38, 138, 85	25	RU-IRK
Калининградская область	39	39, 91	27	RU-KGD
Калужская область	40	40	29	RU-KLU
Кемеровская область	42	42, 142	32	RU-KEM
Кировская область	43	43	33	RU-KIR
Костромская область	44	44, 444	34	RU-KOS
Курганская область	45	45	37	RU-KGN
Курская область	46	46	38	RU-KRS
Ленинградская область	47	47	41	RU-LEN
Липецкая область	48	48	42	RU-LIP
Магаданская область	49	49	44	RU-MAG
Московская область	50	50, 90, 150, 190, 750, 990	46	RU-MOS
Мурманская область	51	51	47	RU-MUR
Нижегородская область	52	52, 152	22	RU-NIZ
Новгородская область	53	53	49	RU-NGR
Новосибирская область	54	54, 154	50	RU-NVS
Омская область	55	55	52	RU-OMS
Оренбургская область	56	56, 156	53	RU-ORE
Орловская область	57	57	54	RU-ORL
Пензенская область	58	58	56	RU-PNZ
Псковская область	60	60	58	RU-PSK
Ростовская область	61	61, 161, 761	60	RU-ROS
Рязанская область	62	62, 662	61	RU-RYA
Самарская область	63	63, 163, 763	36	RU-SAM
Саратовская область	64	64, 164	63	RU-SAR
Сахалинская область	65	65	64	RU-SAK
Свердловская область	66	66, 96, 196	65	RU-SVE
Смоленская область	67	67	66	RU-SMO
Тамбовская область	68	68	68	RU-TAM
Тверская область	69	69	28	RU-TVE
Томская область	70	70	69	RU-TOM
Тульская область	71	71	70	RU-TUL
Тюменская область	72	72	71	RU-TYU
Ульяновская область	73	73, 173	73	RU-ULY
Челябинская область	74	74, 174, 774	75	RU-CHE
Ярославская область	76	76	78	RU-YAR
Москва	77	77, 97, 99, 177, 197, 199, 277, 777, 797, 799, 999	45	RU-MOW
Санкт-Петербург	78	78, 98, 178, 198, 278, 778	40	RU-SPE
Севастополь	92	92	67	RU-SEV
Еврейская автономная область	79	79	99	RU-YEV
Ненецкий автономный округ	83	83	11-8	RU-NEN
Ханты-Мансийский автономный округ — Югра	86	86, 186	71-8	RU-KHM
Чукотский автономный округ	87	87	77	RU-CHU
Ямало-Ненецкий автономный округ	89	89	71-9	RU-YAN
Байконур (Казахстан) и другие территории, находящиеся за пределами РФ и обслуживаемые Управлением режимных объектов МВД России	—	94	—

Игра про танки, самолеты, вертолеты, корабли.

От второй мировой войны до современности. при регистрации по этой ссылке вы дополнительно получите 50 золота при входе в игру

Случайная статья:

Штурмовые Группы ВОВ

Истребители СПАД в России — ЛТХ и фото

Трофейные самолеты ‘Эльфауге’ и ‘Румплер’

Axis tanks in Red Army

Т-34 ЭЛЕКТРИКА ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Коды федеральных субъектов Российской Федерации для налоговой и авто, включая Крым. Вновь вводимые автомобильные коды регионов России 2014, 2021, 2021. Код субъекта РФ 019, 666, новые автокоды регионов ГИБДД — какой город?

Классификации автомобильных масел SAE, API, ACЕA

Переключение АКПП на ходу вручную

Женщина — учебник для мужчин

В начало сайта
старт

Транспортная инфраструктура 86 региона России

Ханты-Мансийский автономный округ-Югра расположен в центре Западносибирской низменности. Его территория растянулась с запада на восток почти на 1 400 км, от Уральского хребта до Обско-Енисейского водораздела. С севера на юг округ раскинулся – на 900 км. Протяженность границ составляет 4 750 км. Граничит с Ямало-Ненецким автономным округом, Томской областью, Тюменской областью, Свердловской областью, Республикой Коми и Красноярским краем.

Мост через реку Иртыш – это визитка города 86 региона Ханты-Мансийска. Его называют «Красный дракон», было принято решение – выкрасить красным цветом конструктивна. Мост является один из самых красивых мостов не только в Западной Сибири, но и России. Мост построен в 2004 году. Он соединил Ханты-Мансийск с западной частью автономного округа, где ближайшим крупным городом является Нягань (280 км). Протяжённость автомобильных дорог — более 18 000 км.

86 регион – Ханты-Мансийский автономный округ на Яндекс карте

Яндекс.КартыХанты-Мансийский автономный округ — Яндекс.Карты

Ханты-Мансийск знаком всем как центр проведения крупнейших международных деловых и спортивных мероприятий. Тут проходят – Чемпионат мира по Биатлону, 39-я Всемирная шахматная олимпиада, Международный IT‑ФОРУМ с участием стран БРИКС и ШОС, международный фестиваль кинематографических дебютов «Дух огня», международный экологический фестиваль «Спасти и сохранить», зимние Сурдо олимпийские игры. Ежегодно Ханты-Мансийск посещает более 100 тысяч туристов, принимает более 30 крупных мероприятий регионального, всероссийского и международного уровней.

Общая площадь области: 534 801 квадратных километров. Округ находится в часовой зоне Екатеринбургского времени. Разница с Москвой составляет 2 часа.

В Регион 86 входят крупные города – Сургут, Нижневартовск, Ханты-Мансийск, Нефтеюганск, Нягань, Радужный, Когалым, Мегион, Лангепас, Пыть-Ях, Урай, Лянтор, Югорск, Советский.

Губернатор Югры Наталья Комарова оценила ход работ на ремонтируемом участке дороги по улице Мира в Ханты-Мансийске в рамках национального проекта «Безопасные и качественные автомобильные дороги».

Как сообщил глава города Максим Ряшин, по плану в 2021 году в муниципалитете в рамках нацпроекта будет отремонтировано 100 тысяч квадратных метров дорог. «Это 25 участков улиц. После выполнения данных работ процент дорог, находящихся в нормативном состоянии на территории Ханты-Мансийской агломерации составит 81,3 процента. Таким образом, по сравнению с 2021 годом, он увеличится на 2,1 процента», – добавил он.

К 2024 году запланировано, в соответствии с нацпроектом доля дорог регионального и межмуниципального значения, которые соответствуют нормативным требованиям, превысит 87 процентов.

В зимнее время, в лютые морозы, в регионе 86 –ХМАО, образовывается много дорог через речки, озера. Эти дороги называются – зимниками. В 2021 году, весна ранняя и зимники превращаются в непроходимые дороги, соответственно приходится ездить в объезд, по более длинному пути.

Таблица кодов регионов

Код	Субъект Российской Федерации
01	Республика Адыгея
02, 102	Республика Башкортостан
03, 103	Республика Бурятия
04	Республика Алтай (Горный Алтай)
05	Республика Дагестан
06	Республика Ингушетия
07	Кабардино-Балкарская Республика
08	Республика Калмыкия
09	Республика Карачаево-Черкессия
10	Республика Карелия
11	Республика Коми
12	Республика Марий Эл
13, 113	Республика Мордовия
14	Республика Саха (Якутия)
15	Республика Северная Осетия — Алания
16, 116, 716	Республика Татарстан
17	Республика Тыва
18	Удмуртская Республика
19	Республика Хакасия
21, 121	Чувашская Республика
22	Алтайский край
23, 93, 123	Краснодарский край
24, 84, 88, 124	Красноярский край
25, 125	Приморский край
26, 126	Ставропольский край
27	Хабаровский край
28	Амурская область
29	Архангельская область
30	Астраханская область
31	Белгородская область
32	Брянская область
33	Владимирская область
34, 134	Волгоградская область
35	Вологодская область
36, 136	Воронежская область
37	Ивановская область
38, 85, 138	Иркутская область
39, 91	Калининградская область
40	Калужская область
41	Камчатский край
42, 142	Кемеровская область
43	Кировская область
44	Костромская область
45	Курганская область
46	Курская область
47, 147	Ленинградская область
48	Липецкая область
49	Магаданская область
50, 90, 150, 190, 750	Московская область
51	Мурманская область
52, 152	Нижегородская область
53	Новгородская область
54, 154	Новосибирская область
55	Омская область
56, 156	Оренбургская область
57	Орловская область
58	Пензенская область
59, 81, 159	Пермский край
60	Псковская область
61, 161, 761	Ростовская область
62	Рязанская область
63, 163, 763	Самарская область
64, 164	Саратовская область
65	Сахалинская область
66, 96, 166, 196	Свердловская область
67	Смоленская область
68	Тамбовская область
69	Тверская область
70	Томская область
71	Тульская область
72	Тюменская область
73, 173	Ульяновская область
74, 174	Челябинская область
75, 80	Забайкальский край
76	Ярославская область
77, 97, 99, 177, 197, 199, 777, 799, 277, 299	г. Москва (коды 277 и 299 ограниченной серии)
78, 98, 178, 198	г. Санкт-Петербург
79	Еврейская автономная область
82	Республика Крым
83	Ненецкий автономный округ
86, 186	Ханты-Мансийский автономный округ — Югра
87	Чукотский автономный округ
89	Ямало-Ненецкий автономный округ
92	г. Севастополь
94	Территории, находящиеся за пределами РФ и обслуживаемые Департаментом режимных объектов МВД России
95	Чеченская республика (код 20 действовал до 2000 года)

Регистрационные знаки 86 региона

Для упорядочения и учета российских автомашин было принято решение ввести регистрационные знаки. Это специальные стандартизированные знаки, их внешний вид определяется ГОСТом. Комбинации на них обозначаются по принципу: три цифры и три буквы. При этом буквами обозначается серия номера, а цифрами непосредственно номерной знак. Буквы используются латинские. Номерной знак владельца автотранспортного средства ХМАО- Югры выглядит стандартно.

В правом нижнем углу номерного знака размещен флаг РФ, а также буквенная комбинация RUS. В правом верхнем углу, над флагом и буквенной комбинацией располагается цифра 86, обозначающая код субъекта, зарегистрированного в Ханты-Мансийском округе. При этом буквы и цифры кода несколько меньше, чем шрифт основных цифр номерного знака.

Самые большие города в республике

• Уфа — 1 110 тыс. чел.
• Стерлитамак — 279 тыс. чел.
• Салават — 153 тыс. чел.
• Нефтекамск — 125 тыс. чел.
• Октябрьский — 113 тыс. чел.

Общая площадь области: 142 947 квадратных километров.

Пробки в Уфе, по данным Яндекса, до 2 баллов.

Автомобилизация в 02 регионе (102 и 702): на 1 человека приходится 0,237 автомобиля по данным за 2013 год. Это значит: одна машина примерно на пятерых людей.

Плотность населения 02 региона (102 и 702) — 28,45 чел./км². (по данным переписи 2021 года).

С 28 августа 2021 года в подразделениях ГИБДД по Башкирии начали выдавать государственные номера с кодом региона 702.

История региона

Калининградская область — уникальный регион России, входящий в ее Северо-Западный федеральный округ. Это самая западная территория, полностью отделенная от остальной части страны сухопутными границами иностранных государств и международными морскими водами.

История Калининградской области своеобразна. Она образована в результате победы Советского Союза над нацистской Германией. По решению Берлинской (Потсдамской) конференции 1945 года 1/3 территории бывшей Восточной Пруссии с городом Кенигсбергом вошла в состав СССР. Принцип нерушимости послевоенных европейских границ был подтвержден более поздними соглашениями.

Указом Президиума Верховного Совета СССР от 7 апреля 1946 года здесь была образована Кёнигсбергская область, которая вошла в состав РСФСР, а 4 июля 1946 года ей было присвоено имя советско­го государственного деяте­ля М.И.Калинина. Летом 1946 года проведено почти полное переименование населенных пунктов, улиц, природных объектов.

Первоначально функции по организации жизни на новой советской территории осуществляли чрезвычайные органы управления: военные и временные гражданские администрации. Первыми советскими гражданами на этой территории стали военнослужащие, небольшие группы работников, «командированных» для вос­становления промышленных предприятий, бывшие узники концлагерей.

Война нанесла непоправимый урон экономике края. Из 364 промышленных предприятий полностью было разрушено 186, а оставшиеся предприятия сильно повреждены. Большинство административных и жилых зданий лежали в руинах. Бездействовали электростанции, транспорт, связь, водопровод, канализация. Значительная часть сельскохозяйственных угодий оказалась затопленной. Серьезной проблемой остались неразорвавшиеся боеприпасы. В июле 1946 года Совет Министров Союза ССР принял два важнейших документа, которые определили направление деятельности органов власти новой области: «О мероприятиях по хозяйственному устройству Кёнигсбергской области» (21 июля 1946 г.) и «О первоочередных мероприятиях по заселению районов и развитию сельского хозяйства Калининградской области» (9 июля 1946 г.). В этих документах содержалась программа экономического возрождения города и области, указывались источники финансирования и снабжения. Так началась новая история этого древнего края.

Заселение Калининградской области относится к числу самых масштабных миграционных процессов послевоенной истории СССР. С августа 1946 года организовано массовое прибытие в область переселенцев из 27 областей России, 8 областей Белоруссии, 4 автономных республик. Это определило многонациональную структуру населения края и образование культуры своеобразного типа, которой характерны взаимодействие и взаимопроникновение традиций и обычаев многочисленных наций и народностей.

В конце 40-х годов была осуществлена принудительная депортация из Калининградской области местного немецкого населения.

На рубеже 1947 — 1948 годов окончательно завершилось создание органов управления новой советской областью на конституционной основе. В мае 1947 года образован Калининградский городской исполнительный комитет, а в декабре проведены первые выборы в местные Советы.

Реализация государственного плана позволила в довольно короткие сроки наладить работу промышленности, основными звеньями которой стали предприятия рыбодобывающего и перерабатывающего комплекса, строительство и ремонт кораблей, целлюлозно-бумажная отрасль, вагоностроительный завод. В 1948 году введен в эксплуатацию Калининградский янтарный комбинат — крупнейшее в мире предприятие по добыче и переработке янтаря. Развивалось портовое хозяйство области. В 1948 году в Северную Атлантику к берегам Ислан­дии отправилась первая промысловая сельдяная экспедиция. Были восстановлены мосты, основные железнодорожные магистрали. В 1949 году открылся для пассажиров отреставрированный Южный вокзал в Калининграде. 7 ноября 1946 года на улицы города вышел первый трамвай. В сентябре 1945 года за парты сели первые ученики школы № 1, вслед за тем школы стали открываться в других городах и поселках. В 1948 году начались занятия в Калининградском государственном педагогическом институте, нескольких техникумах и других учебных заведениях. Своих первых зрителей приняли кинотеатры. В сентябре 1947 года премьерой спектакля по пьесе К. Симонова «Парень из нашего города» открыл свой первый сезон Областной драматический театр. С 1946 года формирует свои коллекции Областной краеведческий музей (ныне Областной историко-художественный музей). В последующие годы он послужил основой для создания музейной сети города и области. Сразу после окончания войны начали принимать отдыхающих на морском побережье первые советские санатории. К середине 60-х годов здесь действовали уже 11 крупных здравниц, которые перешли на круглогодичную работу.

Основная цель государственного плана по превращению области из потребляющей в производящую в основном была достигнута. В советский период создается новая отраслевая структура экономики области. Сформировались основные отрасли народного хозяйства: мощный рыбопромышленный комплекс, ориентированный на лов рыбы в открытом океане; целлюлозно-бумажная, легкая, лесоперерабатывающая, пищевая и добывающая промышленность, машиностроение. В 1975 году началась добыча нефти. В структуре сельского хозяйства преобладало животноводство. Активно развивалась транспортная система региона.

В области был создан крупный образовательный комплекс. В 1958 году из Москвы был переведен Рыбвтуз, преобразованный в Калининградский технический институт рыбной промышленности и хозяйства (сейчас Калининградский государственный технический университет). В 1967 году педагогический институт был реорганизован в Калининградский государственный университет (ныне БФУ им. Канта). В 1966 году открыто Высшее мореходное училище (ныне Балтийская государственная академия рыбопромыслового флота). В настоящее время систему высшего образования региона представляют 6 государственных вузов, 12 негосударственных и 5 региональных вузов.

Город изменил свой облик, превратившись из немецкого Кенигсберга в российский Калининград. Вместе с тем сохранены многие исторические и архитектурные памятники. Как олицетворение общемировой культуры в Калининграде установлены памятники трем великим людям, имена которых известны каждому образованному человеку: немецкому поэту-романтику Ф.Шиллеру (1910 г., скульптор С.Кауэр), великому философу И.Канту (копия памятника Х.Рауха, 1864 г.) и гению русской литературы А.С.Пушкину (1993 г., автор М.К.Аникушин). В реставрированной кирхе Святого Семейства (1904 г., арх. Ф.Хайтман) с 1980 года находится концертный зал областной филармонии с установленным в 1982 году органом. В реконструированной кирхе Королевы Луизы (1901 г., арх. Ф.Хайтман) поселился театр кукол. В восстановленном здании Торговой биржи (1870-75 гг., арх. Г.Мюллер) расположился Дворец культуры моряков. В помещениях башни «Дона»; Королевских, Фридландских городских воротах (XIX в., арх. Э.Л. Астер) открыты музейные экспозиции. В 1985 году руины кирхи Юдиттен (XIII в.) были отданы православной общине. В 1988 году, в дни празднования 1000-летия крещения Руси, здесь прошла первая служба. Реконструированная кирха стала первым православным собором, получившим название Свято-Никольского. Многие из действующих право­славных церквей сегодня размещаются в переосвященных католических и лютеранских кирхах. В 1996 году был заложен православный храм Христа Спа­сителя на площади Победы в Калининграде. В сентябре 2006 года Патриарх Московский и Всея Руси Алексий II совершил Великое освящение храма. В восстановленном Кафедральном соборе на острове Канта, наиболее известном памятнике северогерманской готики, проходят концерты фестиваля «Балтийские сезоны», вновь создан органный комплекс.

В Калининграде немало уголков природы, зелёных и экологически чистых. Одним из них является Ботанический сад, который был основан в 1905 году как питомник городского садоводства. Другим любимым местом отдыха жителей города является зоопарк, который был создан еще в 1896 году, его день рождения — 27 июня 1947 года. Здесь обитают представители фауны всех континентов земного шара.

Современное геополитическое положение Калининградской области накладывает отпечаток на экономику, на все стороны жизни населения. Определяющие отрасли народного хозяйства, важные природно-сырьевые ресурсы области, незамерзающие порты, учебные и культурные учреждения, близость к европейским рынкам определяют судьбу нашего региона. Здесь Россия встречается с соседними странами, здесь укрепляется российская культура на Балтике. 5 июля 1990 года горсовет Калининграда принимает решение об «открытии» города для иностранцев. Предложе­ние об «открытии» области для иностранных граждан реализовано в 1991 году.

Предприни­маются меры, компенсирующие дополнительные затраты из-за более дорогого транзита. Главные из таких мер — закон «Об Особой экономической зоне в Калининградской области» и Федеральная целевая программа развития Ка­лининградской области. С их уче­том разработана и реализуется реальная стратегия социаль­но-экономического развития региона.

Формируется новая структура экономики, в которой большое значение имеет сфера услуг (в особенности транс­порт, торговля, туризм). В области появились новые отрасли промышленности, которых здесь ранее не было, например автомобилестро­ение и производство телевизоров и другой бытовой элек­тронной техники. В области быстрее среднего по России растут транспортные перевозки, обслуживание экспортно-импор­тных связей, отечественный и зарубежный туризм. Рост наблюдается и в ряде других отраслей — строительстве, связи и телекоммуникациях.

На рубеже 1980-х и 1990-х годов в Калининградской обла­сти обострился демографический кризис. Начиная с 1992 года в регионе уровень смертности стал выше, чем уровень рождаемости. Численность населения в Калининградской области возросла из-за высокого миграционного потока за период между перепи­сями населения 1989 и 2002 годов. С 2006 года Калинин­градская область вошла в число 12 пилотных регионов России, где действует Государственная программа по оказанию со­действия добровольному переселению в Российскую Феде­рацию соотечественников, проживающих за рубежом.

Стратегией ставятся две взаимосвязанные цели — обеспечить эффективную конкурентоспособность Калининградской области в Балтийском регионе и достичь уровня жизни и качества среды, соизмеримой со стандартами европейского окружения.

Материал подготовлен Щегловой О.Н., 

заместителем директора Калининградского 

областного историко-художественного музея

Попова назвала четыре региона с напряженной ситуацией с COVID-19 :: Общество :: РБК

В четырех российских регионах идет рост заболеваемости COVID-19, сообщила Попова. Это в том числе Чукотский автономный округ, который пока занимает последнее место по числу заразившихся среди субъектов

Фото: Максим Шипенков / EPA / ТАСС

В стадии роста заболеваемости коронавирусом в России находятся четыре региона: Крым, Владимирская и Астраханская области и Чукотка. Об этом заявила глава Роспотребнадзора Анна Попова.

«Ситуация здесь остается напряженной», — сказала она на заседании президиума координационного совета по борьбе с COVID-19 (трансляцию вел телеканал «Россия 24»).

В то же время глава Роспотребнадзора отметила, что в этих регионах «малые цифры и, конечно, нужно сделать на это скидку».

В Крыму коронавирус выявили у 22 тыс. человек (плюс 354 заразившихся за сутки), во Владимирской и Астраханской областях — 16,9 тыс. (плюс 186 случаев за сутки) и 17,4 тыс. (плюс 180) соответственно, следует из данных оперативного штаба.

Чукотка среди российских регионов по числу заразившихся коронавирусом занимает последнее место. На ней зарегистрировали 498 заболевших COVID-19 (плюс шесть за сутки).

State Route 186 US 45 Bypass Southern Extension

Обзор

Город Джексон в сотрудничестве с TDOT предлагает продлить государственную трассу 186 и объездную дорогу США 45 примерно на 6,78 миль от государственной трассы 1 / США 70 / бульвара Airways на западной стороне Джексона до государственной трассы 5 / США 45 /. Саут-Хайленд-авеню на южной стороне Джексона в округе Мэдисон. Этот проект известен как Южное расширение.

Цель и необходимость

US 45 — это главная магистраль, идущая от Мобила, Алабама, до Мичигана.Это единственный крупный маршрут с севера на юг через Джексон, который служит коридором для путешествий и грузовым маршрутом для транспортных средств, следующих в и из Миссисипи. Это также основной маршрут для жителей округов Честер, Хардеман и Макнейри. Кроме того, US 45 также является единственным крупным пересечением Саут-Форк реки Разветвленный Олень, соединяющим центр Джексона с южными частями города.

Существующая объездная дорога US 45, построенная в конце 1960-х годов, предназначалась для уменьшения заторов на трассе US 45, направляя трафик вокруг центра города Джексон.Объездная дорога соединяет US 45, к югу от центра города Джексон, с межштатной автомагистралью 40, которая находится к северу от зоны проекта. (Участок объездной дороги между I-40 и Airways Boulevard также обозначен как SR 186.)

Целью предлагаемого южного продолжения объездной дороги США 45 является устранение геометрических, эксплуатационных недостатков и недостатков безопасности на маршруте, в том числе неадекватных переходов через Южную развилку реки Разветвленный Олень, что вызывает опасения при реагировании на чрезвычайные ситуации. Предлагаемый проект также улучшит системные связи и увеличит пропускную способность с учетом текущих и будущих объемов трафика.

Предлагаемый проект

Существующая объездная дорога US 45 представляет собой четырехполосную проезжую часть, разделенную травяным или бетонным барьером, в зависимости от местоположения. Предлагаемый проект предусматривает реконструкцию объездной дороги, частично на новой трассе, с обеспечением контролируемого доступа, четырехполосного сооружения с промежуточным барьером.

Карта проекта (pdf)

Обновленный маршрут начинается на западной стороне шоссе US 45, к северу от Эдвардс Драйв и промышленного парка Бонвуд, и продолжается на север до бульвара Airways (США 70 / SR 1), к юго-западу от центра города Джексон.

Новая развязка обеспечит доступ к новой трассе от существующей US 45 (South Highland Avenue). Расширение также будет включать в себя съезды через железную дорогу Западного Теннесси (WTNRR), соединяющую объездную дорогу с существующим шоссе US 45, и соединитель с SR 18 в районе Raines Springs Road. Предварительные проекты включают две дополнительные трассы для подключения к существующему бульвару Airways в северной части проекта (варианты C и C-1).

Доступ к объездной дороге US 45 будет ограничен в следующих местах с юга на север.

• US 45 / South Highland Avenue (развязка с съездами на US 45)
• Raines Springs Road (сигнальный перекресток)
• Улица Д (сигнальный перекресток)
• Boone Lane (несигнальный перекресток)
• Риверсайд Драйв к северу от Северной развилки реки Разветвленный Олень (несигнальный перекресток)
• Существующая объездная дорога US 45 (сигнальный перекресток)

Дополнительно, тупики предлагаются на Кейн Крик Роуд и Бемис Кладбище Роуд.

История проекта

Экологическая оценка (EA) для южного продолжения объездной дороги US 45 была одобрена Федеральным управлением шоссейных дорог (FHWA) в мае 2013 года. После утверждения EA проект был приостановлен до получения финансирования. В 2017 году Генеральная ассамблея Теннесси приняла Закон об улучшении производства, общественных дорог и возможностей для динамичной экономики (IMPROVE), который позволил проекту Южного расширения двигаться вперед.

Из-за того, что проект был приостановлен, потребовалась переоценка EA. Переоценка была одобрена FHWA в июле 2019 года. В настоящее время работы на полосе отвода прогнозируются на 2021 год. (Чтобы просмотреть проектную документацию, посетите раздел «Библиотека» на этом веб-сайте. Чтобы просмотреть статус проекта, посетите раздел «Хронология» на этом веб-сайте. )

Обновление

COVID-19: Район 186 планирует забрать устройства — Новости — Государственный журнал-Регистр

Детский садик в Спрингфилде Мэдисон Фортин получила сообщение от губернатора штата Иллинойс.JB Pritzker за ее участие в поощрении людей оставаться дома во время пандемии COVID-19.

«Ребята, прекратите то, что вы делаете, и послушайте Мэдисон, очень умную воспитательницу детского сада из Спрингфилда», — написал Прицкер в Твиттере. Затем Прицкер процитировал совет Мэдисон из видео в Facebook, которое стало вирусным: «Не ходите на вечеринки. Не ходите в чей-то дом … вы должны оставаться дома … времени.»

В своем сообщении на Facebook Фортин в желтом платье предупредил, что «вы все еще можете гулять, но ничего не трогайте», — сказала она, качая пальцем.Дети могут заниматься спортом, играть и играть в игры, «но старайтесь, чтобы вы большую часть времени оставались дома», — сказала она.

Прицкер поставил Мэдисон «пятерку» за социальное дистанцирование.

Округ 186 Распределение устройств

Спрингфилд Округ 186 начнет раздачу ноутбуков студентам, чтобы обеспечить непрерывность обучения и доступ к возможностям дистанционного обучения на дому.

Государственный суперинтендант образования доктор Кармен И. Айяла объявила в пятницу, что во вторник в школах штата начнутся дни дистанционного обучения, которые продолжатся до возобновления личного обучения.

В каждой школе есть определенный день и время встречи. Устройства отдают предпочтение семьям, у которых дома нет устройств для использования учащимися. Семьи получат подробную информацию о конкретных пунктах подъезда и выезда из соответствующих школ.

Семьям рекомендуется посещать школу, в которой ходит их ученик, только в назначенный день.

Пикап начинается со школ Сэндберга, Джейн Аддамс, Оуэна Марша и Black Hawk с 13 до 15 часов. Понедельник. Расписание вторника — Юго-восточная средняя школа, Хейзел Делл, Грэм и Ли с 9 до 11.м. и Фэйрвью, средняя школа Джефферсона, Лейктаун и Саутерн-Вью с 13 до 15 часов. График работы среды: средняя школа Ланфиера, средняя школа Матени-Витроу, Батлера и Франклина с 9 до 11 часов утра и Гарвард-парк, средняя школа Вашингтона, Риджли и Фейтшанс с 13 до 15 часов.

В четверг расписание средней школы Спрингфилда, Дюбуа, Эноса и МакКлернарда с 9 до 11 часов утра и Линдси, средней школы Гранта, Уилкокса и Айлза с 13 до 15 часов. Расписание пятницы — Springfield Learning Academy и Дуглас с 9 до 11.м.

Для получения дополнительной информации посетите www.sps186.org.

Школьное питание

Спрингфилдский округ 186 по понедельникам продолжает готовить еду на вынос.

Участки включают три средних школы: Спрингфилд, Ланфьер и Юго-Восток; Средние школы Франклина, Вашингтона и Джефферсона; и начальные школы Фейтшанса, Уилкокса, Джейн Аддамс и Риджли.

Два предприятия также продолжают работать в качестве объектов: Офис жилого комплекса Pinewood, 1665 Seven Pines Road, и Antonio’s Pizza, 2701 W.Lawrence Ave.

Встреча с 8:30 до 10:00.

Питание для 117 студентов округа Джексонвилл будет предоставляться по понедельникам, вторникам и четвергам.

Студенты получают двухразовое питание во вторник и четверг.

Еда будет распределена на южной стороне средней школы Джексонвилля с 10:00 до полудня. В то же время питание будет доступно для учащихся начальной школы Мюррейвилл-Вудсон.

Наблюдается за жилым домом для пожилых людей

Жилой дом для пожилых людей в Тейлорвилле помещен на карантин из-за большого количества случаев COVID-19, сообщает Chris-Mont EMA.

Газета Taylorville Daily News сообщила в воскресенье, что в Rolling Meadows Senior Living, 1125 E. 1500 North Rd., Находится карантин после того, как там резко возросло количество случаев COVID-19.

В здание не допускаются посетители. Руководство сотрудничает с карантином и со следствием.

Округ Кристиан сообщил о семи незавершенных тестах на COVID-19, 13 положительных и 25 отрицательных.

Кемпинг на озере Джексонвилл отложен

В связи с пандемией COVID-19, озеро Джексонвилл не откроет сезон кемпинга в среду.

Рыбалка на озере по-прежнему будет разрешена.

17 октября зарегистрировано

1857 новых случаев COVID, 186 из них — в нашем центральном регионе | WTAJ

ХАРРИСБУРГ, Пенсильвания (WTAJ) — Департамент здравоохранения Пенсильвании подтвердил со вчерашнего дня 1857 новых случаев заболевания COVID-19, в результате чего общее количество в штате достигло 180 943.

Количество тестов, проведенных за последние 7 дней с 10 по 16 октября, составляет 234 583 с 9 778 положительными случаями. В отделении было сообщено о 41 794 результатах анализов через 10 р.м., 16 октября.

В настоящее время 2119 850 человек дали отрицательный результат.

По данным Министерства здравоохранения, было зарегистрировано еще 9 смертей, связанных с COVID-19, в результате чего общее число смертей достигло 8466.

Восемьдесят процентов заболевших в Пенсильвании были признаны излеченными от COVID-19.

В нашем регионе Центральная Пенсильвания подтверждено 7526 случаев COVID-19. В нашем регионе на 186 заболевших больше, чем вчера.

Вы можете найти округа в разбивке по округам ниже:

Департамент Пенсильвании.of Health объявили, что больше не будут обновлять панель мониторинга COVID-19 по воскресеньям. В числах за понедельник теперь будут отражаться результаты за субботу и воскресенье.

Школьный округ Холлидейсберга сообщает о случае COVID-19 в начальной школе

Распределение по возрасту пациентов с положительным результатом теста на сегодняшний день выглядит следующим образом:

• Примерно 1% — это люди в возрасте 0–4 лет;
• Около 2% в возрасте от 5 до 12 лет;
• Около 5% — люди в возрасте от 13 до 18 лет;
• Около 14% составляют люди в возрасте от 19 до 24 лет;
• Около 36% — люди в возрасте от 25 до 49 лет;
• Примерно 21% составляют люди в возрасте от 50 до 64 лет; и
• Примерно 21% — люди в возрасте 65 лет и старше.

Большинство госпитализированных пациентов в возрасте 65 лет и старше, и большинство смертей произошло среди пациентов 65 лет и старше.

Департамент отмечает значительный рост числа случаев COVID-19 среди более молодых возрастных групп, особенно среди лиц в возрасте от 19 до 24 лет. Медицинским работникам было отправлено уведомление об изменении демографии заболевших COVID-19, поскольку в более молодых возрастных группах больше случаев, чем в группах 50-64 и 65+. В следующих регионах наблюдался значительный рост числа молодых людей в возрасте от 19 до 24 лет в каждом месяце с апреля по настоящее время в октябре:

• NC — Примерно 7 процентов случаев в апреле до почти 34 процентов случаев в октябре;
• SE — от почти 5 процентов случаев в апреле до примерно 17 процентов случаев в октябре;
• NE — от 6 процентов случаев в апреле до примерно 20 процентов случаев в октябре;
• NW — от почти 7 процентов случаев в апреле до примерно 19 процентов случаев в октябре;
• SW — примерно от 5 процентов случаев в апреле до примерно 13 процентов случаев в октябре; и
• SC — примерно от 7 процентов случаев в апреле до примерно 10 процентов случаев в октябре.

В домах престарелых и персонального ухода зарегистрировано 24 482 случая заболевания COVID-19 и 5 361 случай среди сотрудников, всего 29 843 случая в 1021 учреждении в 62 округах. Из общего числа случаев смерти 5608 человек умерли в учреждениях сестринского ухода или личной гигиены.

Примерно 11 618 случаев из общего числа наших случаев приходится на медицинских работников.

Юго-западный регион

Мексиканский волк — самый редкий подвид серого волка в Северной Америке.Когда-то распространенный в некоторых частях юго-запада Соединенных Штатов, мексиканский волк был практически полностью уничтожен из дикой природы к 1970-м годам. В 1977 году Служба рыболовства и дикой природы США инициировала усилия по сохранению этого вида. В 1998 году мексиканские волки впервые были выпущены в дикую природу в зоне восстановления Голубого волка в пределах экспериментальной зоны популяции мексиканских волков. Вой мексиканского волка, пропавший с ландшафта более 30 лет назад, снова можно услышать в горах на юго-западе США.

Мексиканский волк возвращен на свою территорию в Национальном лесу во время подсчета и отлова в 2019 г. Фото: Эвелин Личва / Межведомственная полевая группа Mexican Wolf.

Дикая популяция мексиканских волков растет пятый год подряд

Март 2021 г.
В 2020 году численность дикой популяции мексиканских волков в Соединенных Штатах растет пятый год подряд.Согласно последним подсчетам, популяция мексиканских волков в США увеличилась на 14% с прошлого года, в результате чего общее количество волков в дикой природе составляет минимум 186 животных.

С ноября 2020 года по январь 2021 года Межведомственная полевая группа (IFT) провела наземный учет в Аризоне и Нью-Мексико, который завершился воздушным учетом мексиканских волков в январе и феврале. Согласно IFT, 186 волков распространены: 114 в Нью-Мексико и 72 в Аризоне. В 2019 году команда задокументировала минимум 163 волка, что на 24% больше, чем в 2018 году.Это население почти удвоилось за последние пять лет.

Подробнее.

Пресс-релизы для Mexican Wolf

2018 Мексиканский счет волков повод для оптимизма

Служба

и партнеры отмечают 20-ю годовщину выпуска мексиканских волков в дикую природу

Чтобы получить дополнительные выпуски новостей USFWS Mexican Wolf, посетите раздел новостей и поищите мексиканский волк.

По регионам Архивы — страница 143 из 200

Michigan Pomesters совместно с Ассоциацией улучшения качества яблок Среднего Запада организовали прием во время ежегодного собрания Международной ассоциации фруктовых деревьев в середине февраля в Гранд-Рапидс, штат Мичиган. Светское мероприятие прошло вместо … подробнее »

Сельское хозяйство, поддерживаемое сообществом, или CSA, напрямую связывает потребителей и производителей, помогая создать более прибыльную и прозрачную местную продовольственную систему.CSA существуют некоторое время, но адаптировались к изменениям на рынке, … подробнее »

Адриан Кард, агент по расширению округа Боулдер и член учредительного совета Ассоциации производителей фруктов и овощей Колорадо (CFVGA), был назван Членом года Роберта Сакаты 2019 CFVGA. Честь была … подробнее »

Applewood Fresh Growers LLC из Спарты, штат Мичиган, 4 марта объявила, что Николас Маскари решил уйти с поста президента и миноритарного владельца с 3 марта 2020 года.Согласно пресс-релизу, Mascari будет … подробнее »

Американские производители вишни не будут обжаловать постановление Комиссии по международной торговле от 14 января о том, что импорт сушеной терпкой вишни по несправедливой цене не наносит вреда отечественной промышленности. «Мы посчитали, что это не … подробнее»

Джордж У. Берд, доктор философии, получит награду за выдающиеся заслуги перед факультетом Колледжа сельского хозяйства и природных ресурсов (CANR) Мичиганского государственного университета (MSU) 2020 во время недели ANR 6 марта.Премия «Выдающийся факультет» награждает преподавателей … подробнее »

Калифорнийские правообладатели водных ресурсов обязаны по закону штата измерять и сообщать о воде, которую они отводят из поверхностных водотоков. Для тех, кто хочет самостоятельно измерить воду, Кооперативное расширение Калифорнийского университета … подробнее »

Более 300 производителей, смежных отраслевых компаний, покупателей продукции и других энтузиастов продукции собрались 25-26 февраля в Денвере на 6-ю ежегодную конференцию Ассоциации производителей фруктов и овощей Колорадо (CFVGA).Недавно избран в CFVGA … больше »

Домен, содержащий домен 2 фосфатазы-1, гомологии Src, является внутренним центральным регулятором функции дендритных клеток

Abstract

Дендритные клетки (ДК) инициируют провоспалительные или регуляторные Т-клеточные ответы, в зависимости от их состояния активации. Несмотря на обширные знания о сигналах активации постоянного тока, понимание сигналов подавления постоянного тока относительно ограничено. Мы показываем, что домен Src гомологии области 2, содержащий фосфатазу-1 (SHP-1), является важным ингибитором передачи сигналов DC, нацеленного на множественные пути активации.Ниже TLR4 SHP-1 обнаруживает повышенное взаимодействие с некоторыми белками, включая IL-1R-ассоциированную киназу-4, и модулирует передачу сигналов LPS путем ингибирования активности NF-κB, AP-1, ERK и JNK, одновременно повышая активность p38. Кроме того, SHP-1 ингибировал передачу сигналов о выживании через активацию AKT. Кроме того, SHP-1 ингибировал экспрессию белка CCR7. Ингибирование SHP-1 в DC увеличивало продукцию провоспалительных цитокинов, IL-6, IL-12 и IL-1β, способствовало выживанию и увеличивало миграцию DC в дренирующие лимфатические узлы.Введение SHP-1-ингибированных DCs in vivo индуцировало экспансию Ag-специфических цитотоксических Т-клеток и ингибировало индукцию регуляторных Т-клеток Foxp3 ⁺ , что приводило к усиленному иммунному ответу против предустановленной меланомы мыши и опухолей простаты. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что SHP-1 является внутренним глобальным регулятором функции DC, контролирующим многие аспекты иммунных ответов, опосредованных Т-клетками.

Дендритные клетки (ДК) — это специализированные АРС, которые инициируют и направляют врожденные и адаптивные иммунные ответы при распознавании чужеродных сигналов или сигналов самоопасности (1, 2).Они делают это путем созревания, что приводит к усилению активности молекул адгезии, молекул MHC, костимулирующих молекул и хемотаксического рецептора CCR7 лимфатических узлов (LN). Повышающая регуляция CCR7 позволяет DC мигрировать в локальные LN, где они встречаются с Т-клетками (3), и в зависимости от их состояния активации они могут вызывать различные иммуногенные или толерогенные ответы (4, 5). Сигналы, индуцированные лигированием рецепторов распознавания образов, молекул MHC, костимулирующих молекул (например, CD40 и CD80) и рецепторов воспалительных цитокинов (например,g., IFN-γR и TNFR) активируют DC, позволяя им управлять иммуногенными Т-клеточными ответами. Напротив, сигналы, индуцированные лигированием ингибиторных и коингибиторных рецепторов (например, членов семейства ингибирующих Ig-подобных транскриптов) и супрессорных цитокиновых рецепторов (например, рецепторов IL-10R и TGF-β), могут приводить к DC-опосредованным ответам регуляторных Т-клеток. (6). Несмотря на твердое понимание активации передачи сигналов рецептора внутри DCs, механизмы ингибирующей передачи сигналов, которые модулируют активацию DC, менее ясны.

Тирозинфосфатаза-1, содержащая домен области 2 гомологии Src (SHP-1), экспрессируется в большом количестве иммунных клеток, где она играет в значительной степени ингибирующую роль в передаче клеточных сигналов, инициируемой посредством ряда цитокинов, хемокинов, факторов роста, и стимулы AgR (7). Хотя передача сигналов SHP-1 изучалась в лимфоцитах и ​​моноцитах, его специфическая для DC роль не была хорошо изучена. Исследования, касающиеся функции SHP-1 в DC, обычно выполнялись с использованием штаммов мышей motheaten ( me / me ) и motheaten viable ( me ^v / me ^v ), которые являются спонтанно возникающими SHP. -1 –дефицитные штаммы.У этих мышей наблюдается глобальная дисрегуляция гематопоэтического компартмента, что приводит к тяжелому аутоиммунитету в течение первых нескольких недель жизни (8). DC от мышей me, ^v / me ^v гиперчувствительны к передаче сигналов GM-CSFR (9) и активно накапливаются в легких, что способствует повышенной восприимчивости к астме (10). Кроме того, миелоидные клетки (предшественники DC) мышей me, ^v / me ^v демонстрируют повышенную выживаемость, рост клеток, активацию и хемотаксические ответы (11).Однако в этих исследованиях трудно различить внутренние и внешние эффекты DC, поскольку SHP-1 недостаточен во всех соматических клетках.

Доказательства внутренней роли SHP-1 в DCs получены из наблюдений, что несколько рецепторов, ингибирующих DC (например, Ig-подобный транскрипт 3, FCγRIIB, сигнальный регуляторный белок-1α и Ig-подобные лектины, связывающиеся с сиаловой кислотой), задействуют SHP-1 к их цитоплазматическим доменам (7, 12). Несмотря на последствия такого набора, специфические сигнальные и функциональные последствия активации SHP-1 в DCs неясны.Недавно сообщалось о роли SHP-1 в регуляции активности TLR4 в DC (13). В этом исследовании авторы показали, что SHP-1 ингибирует TLR4-индуцированную передачу сигналов NF-κB, одновременно способствуя индуцированному TLR4 переключению на продукцию IFN типа I. Кроме того, в лимфоцитах, NK-клетках и макрофагах SHP-1 может регулировать такие пути, как PI3K / AKT, JAK / STAT, передачу сигналов хемокинового рецептора и активацию NF-κB (7, 14), все из которых функционально важны для DC. Более того, SHP-1 может модулировать передачу сигналов MAPK, как положительно, так и отрицательно, в зависимости от типа клеток (15-17).Эти наблюдения привели нас к гипотезе о том, что SHP-1 может быть ключевым регулятором, присущим DC, и тем самым может управлять ответами нижестоящих Т-клеток.

В этом исследовании, чтобы изучить его роль DC-внутренней, мы модулировали активность SHP-1 в DC дикого типа (WT) с помощью РНК-интерференции (RNAi), химического ингибирования и сверхэкспрессии ферментативно мертвого мутанта SHP-1. Мы показываем, что в DCs, SHP-1 модулирует передачу сигнала MAPK и ингибирует активность NF-κB и AP-1. Ингибирование SHP-1 в DC также приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов и активации AKT, что соответствует увеличению выживаемости DC.Хотя ингибирование SHP-1 не влияет на большинство маркеров созревания DC, CCR7 активируется и приводит к усилению миграции DC в дренирующие LN in vivo. Важно отметить, что мыши, вакцинированные SHP-1-ингибированными DC, вырабатывают эффективные иммунные ответы как против меланомы, так и против опухолей простаты. Наши исследования демонстрируют, что SHP-1 является внутренним ингибитором передачи сигналов DC, контролирующим широкий спектр функций, необходимых для инициации Т-клеточного иммунитета.

Материалы и методы

Мыши и клеточные линии

WT C57BL / 6 в возрасте от 3 до 5 недель, me ^v / me ^v и экспрессия OVA-специфического TCR (OT-I) трансгенные мыши (18) были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн).Всех мышей содержали в учреждении по выращиванию трансгенных мышей, свободных от патогенов, в Медицинском колледже Бейлора (Хьюстон, Техас). Селекция и эксперименты in vivo проводились в соответствии с протоколами, утвержденными комитетами по уходу за животными и их использованию. Линии клеток опухоли простаты HEK293, RAW 264.7, B16-F10 и TRAMP-C2 были получены из Американской коллекции культур тканей (Манассас, Вирджиния). Линия DC мыши D2SC / 1 была получена от Dr. S.-M. Канг (Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Калифорния) (19).

Реагенты, цитокины и Abs

Для использования в культуре клеток стибоглюконат натрия (SSG), LPS и MG132 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) разводили в стерильном PBS и использовали до конечной концентрации 10 мкг / мл, 0,1–1 мкг / мл и 1 мкМ соответственно. Мышиные цитокины CCL21, IL-4, GM-CSF, IL-10 (PeproTech, Rocky Hill, NJ) и IFN-γ (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) использовали для культивирования или стимуляции ДК костного мозга (BMDC). ). Фосфо-вестерн-блоттинг проводили с использованием Abs к фосфо (p) -SAPK / JNK, SAPK / JNK, p-p38, p38, p-ERK, ERK, p-AKT (S473), p-AKT (T308), AKT, и p-3-фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа-1 (PDK1) (S244) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA).Другими используемыми для вестерн-блоттинга Abs были мышиные антитела к гемагглютинину (HA) (Covance, Emeryville, CA), козьи антитела против HA (Genscript, Piscataway, NJ) и антитела, специфичные для SHP-1, GAPDH, IL-1R-ассоциированной киназы (IRAK) 4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), фосфотирозин (клон 4G10; Millipore, Billerica, MA) и β-актин (Sigma-Aldrich). Конъюгированные с флуорохромом mAb против мышиных CD11c, CD40, CD80, CD86, CD54 (ICAM), IA ^b (BD Pharmingen), CD4, CD8, CD25, IFN-γ, Foxp3, CD3, IL-4, IL-17, CD44, CD-62L и CCR7 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) использовали для проточной цитометрии.

Культура BMDC

Клетки костного мозга вымывали из бедренных и большеберцовых костей мышей WT в возрасте 6-8 недель и культивировали в течение 5-7 дней в среде RPMI 1640, содержащей 10 нг / мл GM-CSF и IL-4. , каждый, 10% FBS и 50 мкм бета-меркаптоэтанол, как описано ранее (20). На 6 день клетки либо сортировали с помощью MACS с использованием анти-CD11c-конъюгированных магнитных шариков (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), либо оставляли несортированными до заражения аденовирусом для использования в качестве исследований вакцин in vivo или различных анализов in vitro.

Клонирование полноразмерного SHP-1 и создание доминантно-отрицательного мутанта SHP-1

Полноразмерный мышиный SHP-1 (WT-SHP-1) клонировали из кДНК селезенки мыши в вектор экспрессии pAdTrack (Stratagene, La Jolla, CA) с помощью ПЦР с использованием N-концевой метки HA и прямого праймера, содержащего сайт рестрикции XhoI, 5′-GCCTCGAGCACCATGTACCCATATGACGTTCCAGACTACGCGGTGAGGTGGTTTCACCGAGACC-3 ‘и обратного праймера, содержащего сайт рестрикции HindTIII 3’GCAAGTC, содержащего сайт рестрикции HindTTCTGCAAGTC 5′-CCTACT, GCCAAGTC, 5′-CTACT, GCCAAGTC’ Доминантно-отрицательный (DN) мутант SHP-1 (C453S) был создан с помощью ПЦР с использованием точечной мутации, содержащей прямой праймер 5′-CATTGTGCATTCCAGCGCTGGCATCGG-3 ‘, и точечную мутацию, содержащую обратный праймер 5′-CCGATGCCAGCGCTGGAATGCACAATG-3’ в комбинации с описаны клонирующие праймеры.

Аденовирусы

SHP-1-специфическая короткая шпилечная РНК мыши (shRNA), содержащая последовательность 5′-GGAGCATGACACAGCAGAATA-3 ‘, была сконструирована и клонирована в аденовирусный вектор с использованием векторов шлюза pAd-BLOCK-iT-DEST для РНКi (Invitrogen, Карловы Вары, Калифорния). HA-меченный WT-SHP-1 (Ad5-WT-SHP-1) и HA-меченный DN-SHP-1 (Ad5-DN-SHP-1) клонировали в аденовирусные векторы с использованием системы Ad-Easy (Stratagene). Все аденовирусы были созданы в клетках HEK293, и их крупномасштабные препараты, включая препараты контрольных Ad5-scrambled-shRNA и Ad5-CMV-Empty, были сделаны в векторном ядре Baylor College of Medicine.

Репортерные анализы

Всего 1–10 мкг репортерных плазмид pSh2-NF-κB-SEAP или pSh2-AP-1-SEAP (20) трансфицировали в 5–10 × 10 ⁶ клеток RAW 264.7 или BMDC. В некоторых анализах клетки котрансфицировали экспрессирующими плазмидами WT-SHP-1 или DN-SHP-1 или предварительно трансфицировали Ad5-WT-SHP-1 или Ad5-DN-SHP-1 за 24 часа до репортерной трансфекции. Клетки RAW 264.7 трансфицировали электропорацией в следующих условиях: 250 мВ и 950 мкФ. BMDC трансфицировали с использованием технологии нуклеофекции (Amaxa, Walkersville, MD) (протокол Y-001).Через 24 часа после трансфекции 10 ⁵ клеток / группу клеток обрабатывали в трех повторах различными стимулами в течение ночи, после чего клетки нагревали при 68 ° C в течение 1 часа и супернатанты инкубировали с субстратом 4-метилумбеллиферилфосфата ( Sigma-Aldrich) в течение 3–24 ч. Флуоресценцию детектировали с помощью планшет-ридера.

DC анализы выживания

CD11c ⁺ MACS-сортированные или несортированные объемные BMDC трансдуцировали либо Ad5-SHP1-shRNA, либо Ad5-scrambled-shRNA, обрабатывали SSG или оставляли без обработки в качестве контроля.Вирус вымывался через 2 ч. Всего 2 × 10 ⁶ BMDC / группу использовали для определения выживаемости клеток путем двойного окрашивания йодидом пропидия и аннексина V с последующим проточным цитометрическим анализом в течение 2-недельного периода.

Анализы миграции DC in vitro

Ночью обработанные SSG или необработанные BMDC промывали и ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI 1640 (SFM) в количестве 5 × 10 ⁵ клеток / 100 мкл. Пятьсот микролитров SFM, содержащего 200 нг / мл CCL21 (PeproTech) и 20 мкг / мл либо CCR7-нейтрализующего Ab (клон 4B12; eBioscience), либо контрольного Ab изотипа крысы (eBioscience) добавляли в нижнюю лунку 24- пластина Transwell (Корнинг, Корнинг, Нью-Йорк) в качестве средства для незаконного оборота.SFM без CCL21 использовали в качестве контроля. Сто микролитров клеточной суспензии загружали в каждую камеру Transwell с порами 5 мкм, которую помещали в лунки с подходящей средой для переноса. Планшет инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч. Мигрировавшие клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Вестерн-блоттинг и анализ иммунопреципитации

Для вестерн-блоттинга лизаты клеток готовили в буфере для лизиса (0,002 М Трис, 0,14 М NaCl и 0,025% NaN. ₃ ), содержащем 1% Nonidet P-40 и протеазу и фосфатазу. смесь ингибиторов (Roche, Florence, SC).Для фосфо-вестерн-блоттинга BMDC голодали по сыворотке в течение 16 часов в присутствии или в отсутствие SSG перед стимуляцией. На следующий день 5 × 10 ⁶ клеток / группу обрабатывали LPS в различные моменты времени или оставляли без обработки в качестве контроля. Стимуляции останавливали добавлением ледяного PBS, клетки собирали и готовили лизаты. Для иммунопреципитации клетки D2SC / 1 трансдуцировали контрольными Ad5-CMV-empty, Ad5-DN-SHP-1 или Ad5-WT-SHP-1 при 40000 вирусных частиц на клетку. Через 24 часа после трансдукции клетки либо стимулировали LPS в течение 10 минут, либо оставляли нестимулированными.Для остановки стимуляции использовали ледяной PBS. Клетки собирали и трижды промывали ледяным PBS, и лизаты получали с использованием буфера для лизиса, содержащего смесь ингибиторов протеазы и фосфатазы, 2 мМ EDTA, 20 мМ HEPES и 0,5% Triton X-100. Предварительно очищенный лизат (1500–2000 мкг) из каждого образца инкубировали с 3–4 мкг иммунопреципитирующего Ab на качающейся платформе в течение 30 мин при 4 ° C. К смеси добавляли восемьдесят микролитров гранул протеин G-агарозы (Roche) и инкубировали еще 2 часа при 4 ° C.Гранулы промывали пять раз буфером для лизиса и кипятили с 2-кратным буфером Лэммли. Лизаты обрабатывали на геле SDS-PAGE, переносили и блотировали с использованием стандартных процедур вестерн-блоттинга.

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени

Для количественного определения уровней мРНК CCR7 и SHP-1 в BMDC мРНК очищали с помощью TRIzol (Invitrogen) и подвергали обратной транскрипции с использованием стандартных протоколов перед проведением TaqMan ПЦР в реальном времени на кДНК с использованием праймера / зонда. наборы, специфичные для CCR7, SHP-1 и GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием системы обнаружения последовательности ABI / PRISM7000 (Applied Biosystems).Все образцы были проанализированы в двух экземплярах, и уровни мРНК CCR7 и SHP-1 в каждом образце были нормализованы к внутреннему контролю GAPDH с использованием метода анализа 2 ^-ΔΔCT (21).

Анализы пролиферации Т-клеток in vitro

В модифицированные или немодифицированные BMDC в течение ночи вводили 25 мкМ либо OVA _257–264 (SIINFEKL), либо тирозиназоподобного белка-2 (TRP-2) _181–188 (SVYDFFVW) ) и совместно культивировали с 10 ⁵ трансгенных отвечающих на ОТ-1 спленоцитов, лизированных эритроцитами, в различных соотношениях.Через двадцать четыре часа к этим культурам добавляли 1 мкКи тимидина. Еще через 16 часов включение тимидина измеряли путем подсчета радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Анализ Т-клеток in vivo

Селезенки собирали у экспериментальных мышей через 1 неделю после вакцинации, готовили суспензии единичных клеток и лизировали эритроциты с использованием буфера ACK. Фенотип Т-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии с окрашиванием на внутриклеточные цитокины IL-4, IL-17, IFN-γ и Foxp3 после пермеабилизации клеток с использованием набора BD Cytoperm Cytofix (BD Biosciences).

Эксперименты с опухолевой вакциной in vivo

BMDC трансдуцировали кшРНК Ad5-SHP-1, Ad5-DN-SHP-1 или контрольными вирусами или оставляли нетрансдуцированными и созревали с помощью 1 мкг / мл LPS. За двадцать четыре часа до трансдукции в BMDC пульсировали 25 мкМ пептида TRP-2 для экспериментов с опухолевой вакциной B16 или пульсировали лизатами цельных клеток TRAMP-C2 для экспериментов с опухолевой вакциной TRAMP-C2. Лизаты цельных клеток TRAMP-C2 получали путем трехкратного быстрого замораживания-оттаивания клеток, встряхивания и центрифугирования.Супернатант лизатов собирали и использовали для импульса BMDC при соотношении TRAMP-C2: BMDC 3: 1. Эктопические опухоли были установлены у мышей WT путем инъекции 5 × 10 ⁴ клеток B16 или 10 × 10 ⁶ клеток TRAMP-C2. Мышей, несущих опухоль, вакцинировали 2–3 × 10 ⁶ подготовленных BMDC, каждую через i.p. или п. Пути 3-х дневной послеродовой инокуляции. Рост опухоли измеряли каждые 3–4 дня штангенциркулем. Объем опухоли рассчитывали по формуле m ₁ ² × m ₂ × 0.5236, где m ₁ — больший размер опухоли.

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с использованием теста Стьюдента t или однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом достоверной значимой разницы Тьюки-Крамера с использованием программного обеспечения JMP IN 5.1.2 (SAS, Кэри, Северная Каролина).

Результаты

SHP-1 ингибирует активацию NF-κB и AP-1 и продукцию цитокинов в DC

Сначала мы спросили, регулирует ли SHP-1 передачу сигналов через один (или несколько) из четырех основных рецепторов DC: IFN-γR, IL -10R, CCR7 и TLR4.Поскольку эти рецепторы могут активировать NF-κB и AP-1 (22-25), мы первоначально определили влияние низкомолекулярного ингибитора SHP-1 SSG (26) на лиганд-опосредованную индукцию репортера NF-κB и AP-1 (рис. . 1 А , 1 В ). Ингибирование SHP-1 в первичных BMDC мыши увеличивало индуцированную LPS-, CCL21-, IFN-γ- и IL-10 активность NF-κB в 5, 2,6, 2,6 и 2 раза соответственно (рис. 1). А ). Обработка SSG усиливала CCL21- и IFN-γ-индуцированную активность AP-1 в 2 раза, в то время как она не влияла на LPS- и IL-10-индуцированную активность AP-1 (рис.1 В ). Эти результаты показывают, что SHP-1 ингибирует передачу сигналов через множество рецепторов и регулирует передачу сигналов NF-κB и AP-1 в DC.

РИСУНОК 1.

SHP-1 регулирует активацию DC NF-κB и AP-1 и продукцию цитокинов. Репортерные анализы NF-κB ( A ) или AP-1 ( B ) проводили в обработанных SSG или необработанных BMDC, стимулированных LPS (1 мкг / мл), IFN-γ (500 Ед / мл), CCL21 ( 200 нг / мл), IL-10 (100 нг / мл) или не стимулировали. Оси и показывают кратную разницу по сравнению с необработанной группой.Гистограммы представляют два-три независимых эксперимента и показаны как среднее ± стандартная ошибка среднего для трех повторов в одном и том же эксперименте. C , Иммуноблот-анализ экспрессии Ad5-DN-SHP-1 и Ad5-WT-SHP-1 в BMDC с Ab, специфичным для HA-метки. Вестерн-блоттинг повторяли дважды. D , Иммуноблот-анализ нокдауна белка SHP-1 с помощью shРНК Ad5-mSHP-1 или контрольной кшРНК, скремблированной с помощью Ad5, в BMDC через 48 ч поствирусной трансдукции или ложной (без вируса) трансдукции. Вестерн-блоттинг повторяли не менее трех раз. E , IL-12 p70, IL-1β, IL-6 и TNF-α ELISA, выполняемый на супернатантах от необработанных или обработанных SSG BMDC, Ad5-SHP-1 shRNA (SHP-1 shRNA) — или Ad5-scrambled КМК, трансдуцированные shRNA (scram shRNA), или Ad5-WT-SHP-1–, Ad5-DN-SHP-1–, или контрольные BMDC, трансдуцированные с помощью Ad5-CMV empty, в присутствии или отсутствии 1 мкг / мл LPS в течение 24 час Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для дубликатов в рамках одного и того же эксперимента. Опыты повторяли трижды. F , TNF-α ELISA, выполняемый на супернатантах от BMDC, культивированных в среде без цитокинов в течение ночи в присутствии или в отсутствие SSG и стимулированных в течение ночи IL-4 или GM-CSF.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для дубликатов в рамках одного и того же эксперимента. Опыты повторяли дважды.

Поскольку NF-κB и AP-1 важны для регуляции цитокинов (27), мы затем спросили, модулирует ли SHP-1 продукцию цитокинов в DC. Чтобы проверить это, мы использовали три метода ингибирования SHP-1 в BMDC: 1) лечение SSG; 2) сверхэкспрессия DN-SHP-1; и 3) SHP-1-специфические РНКи (рис. 1 E ). DN-SHP-1 был создан путем создания точечной мутации C453S в фосфатазном домене WT-SHP-1 для каталитической инактивации SHP-1 (28).DN-SHP-1 функционально усиливал активность NF-κB в BMDC, и этот уровень был сопоставим с уровнем, достигнутым при лечении SSG (данные не показаны). КшРНК DN-SHP, WT-SHP-1 и SHP-1 были клонированы в аденовирусные векторы, и была определена их экспрессия (рис. 1 C ) и специфичный для SHP-1 нокдаун (рис. 1 D ). титрованием вирусных частиц на BMDC. Хотя ингибирование SHP-1 оказывало минимальное влияние на продукцию базальных цитокинов, ингибирование SHP-1 с помощью SSG, shRNA или DN-SHP-1 усиливало индуцированную LPS продукцию IL-12 p70, IL-1β и IL-6 при выходе из LPS. -индуцированная продукция TNF-α не изменилась (рис.1 E ). Этот эффект ингибирования SHP-1 на LPS-индуцированную продукцию цитокинов также наблюдался при более низких концентрациях LPS (от 10 нг / мл до 1 мкг / мл) (дополнительный рисунок 1). Обработка CCL21 умеренно увеличивала LPS-индуцированную продукцию IL-6, которая дополнительно индуцировалась обработкой SSG (дополнительная фигура 2 A ). Однако CCL21 не изменял эффекты LPS или SSG на IL-12 p70 (дополнительная фигура 2 B ). Хотя один IFN-γ не влиял на продукцию каких-либо тестируемых цитокинов, IFN-γ синергетически усиливал эффект ингибирования SHP-1 на LPS-индуцированный IL-6 (дополнительный рис.2 C ) и IL-12 p70 (дополнительная фиг. 2 D ), но не влияли на LPS-индуцированный TNF-α (дополнительная фиг. 2 E ) или IL-1β (дополнительная фиг. 2 F ) производство. Взятые вместе, эти данные показывают, что ингибирование SHP-1 увеличивает продукцию провоспалительных цитокинов с помощью передачи сигналов LPS, IFN-γ и CCL21, возможно, из-за способности SHP-1 ингибировать передачу сигналов NF-κB и AP-1.

SHP-1 также может регулировать передачу сигналов через DC, дифференцирующие цитокины IL-4 и GM-CSF, дефосфорилируя JAK / STAT ниже их рецепторов (9, 29).Чтобы определить, влияет ли SHP-1 на передачу сигналов IL-4 и GM-CSF в DC, мы стимулировали BMDC с помощью IL-4 или GM-CSF и измеряли экспрессию TNF-α. Как сообщалось ранее (30), лечение ИЛ-4 ингибировало продукцию TNF-α, а GM-CSF увеличивало продукцию TNF-α. Ингибирование SHP-1 синергетически с IL-4 и GM-CSF для дальнейшего ингибирования или усиления продукции TNF-α, соответственно (фиг. 1 F ). В совокупности наши результаты показывают, что в DC SHP-1 может модулировать передачу сигналов ниже основных рецепторов DC TLR4, IFN-γR, IL-10R, CCR7, IL-4R и GM-CSFR и регулировать продукцию провоспалительных цитокинов.

SHP-1 участвует в отрицательной обратной связи LPS-индуцированной передачи сигналов в DC

Для предотвращения аутоиммунитета чрезмерная активация передачи сигналов TLR4 регулируется индукцией ингибирующих молекул (31). Мы показали, что SHP-1 может ингибировать NF-κB и AP-1 ниже TLR4 в DC (рис. 1 A , 1 B ). Но что интересно, сам NF-κB связывает промотор SHP-1 (14), что указывает на механизм отрицательной обратной связи, регулирующий сигналы TLR4. Поэтому мы спросили, изменяет ли LPS экспрессию SHP-1 в BMDC.Стимуляция LPS быстро индуцировала экспрессию нативного белка SHP-1 по сравнению с базовыми уровнями, начиная с 5 мин после стимуляции и продолжая по крайней мере до 1 ч после стимуляции (фиг. 2 A ). Эта быстрая индукция белка SHP-1 происходит со скоростью, которая, вероятно, не достигается за счет экспрессии de novo, что позволяет предположить, что уровни SHP-1 могут регулироваться посттранскрипционно. Чтобы определить это, мы спросили, изменяет ли ЛПС скорость деградации белка SHP-1 или стационарные концентрации мРНК SHP-1. Инкубация BMDC с протеасомным ингибитором MG132 стабилизирует белок SHP-1 в течение 5 мин после его добавления (рис.2 А ). Эта стабилизация дополнительно усиливается за счет одновременного добавления LPS в среду (рис. 2 A ). Добавление MG132 или комбинации MG132 и LPS, наоборот, не оказало влияния на стационарные уровни мРНК SHP-1 (фиг. 2 B ). Взятые вместе, эти данные предполагают, что уровни белка SHP-1 подвергаются быстрому обновлению в клетках и что уровни белка быстро стабилизируются при стимуляции LPS, по крайней мере частично, за счет снижения скорости протеасомной деградации.

РИСУНОК 2.

SHP-1 регулирует LPS-индуцированную передачу сигналов MAPK. A , Иммуноблот-анализ экспрессии белка SHP-1 в необработанных BMDC или в тех, которые стимулировались в течение разных периодов времени 100 нг / мл LPS, MG132 или обоих. Тот же самый блот был очищен и повторно зондирован для контроля загрузки (β-актин). Гистограмма представляет изменение экспрессии SHP-1 по сравнению с необработанными BMDC, определенное денситометрией, проведенное на тех же блотах, и нормализованное к контролю нагрузки. Блоты представляют собой результаты двух-трех независимых экспериментов. B , анализ мРНК SHP-1 из необработанных BMDC или BMDC, стимулированных в течение разных периодов времени 100 нг / мл LPS, MG132 или обоими как кратное изменение по сравнению с необработанными BMDC. Гистограмма представляет объединенные данные четырех независимых экспериментов. C , Иммуноблот-анализ 1 мкг / мл LPS-индуцированной активации MAPK в необработанных на ночь BMDC, обработанных SSG. Лизаты исследовали на p-ERK, p-p38 MAPK и p-JNK. Разделительные линии указывают на разные части одного и того же геля. Те же блоты очищали и повторно зондировали на уровни общего белка и β-актина в качестве контроля загрузки. D , Анализы коиммунопреципитации, выполненные в клетках D2SC / 1, трансдуцированных Ad5-WT-SHP-1, Ad5-DN-SHP-1 или контрольным Ad5-CMV-empty (имитация) и стимулированных 100 нг / мл LPS в течение 10 мин или не лечить. Клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации с использованием антител против НА и определяли коиммунопреципитацию тирозин-фосфорилированных белков или SHP-1 в качестве контроля иммунопреципитации. Стрелки указывают те белки, которые дифференцированно коиммунопреципитируются в присутствии LPS. *, Полоса при молекулярной массе составляет 54 кДа.Лизаты цельных клеток (WCL) исследовали на HA и GAPDH в качестве контроля трансдукции и нагрузки, соответственно. E , Клеточные лизаты, обработанные как в D , подвергали иммунопреципитации с использованием антител против НА и зондировали на IRAK4 и наоборот. Положительный контроль (полоса WCL) содержит 5 мкг WCL из образца WT-SHP-1. WCL исследовали на наличие HA и GAPDH в качестве контроля трансдукции и нагрузки, соответственно. Все блоты представляют результаты двух-трех независимых экспериментов.

В DCs, TLR4-опосредованные функциональные изменения частично регулируются активацией MAPKs (2).Хотя MAPK ERK и JNK в первую очередь способствуют созреванию DC и продукции провоспалительных цитокинов (32, 33), p38 способствует поддержанию незрелого фенотипа и продукции регуляторных цитокинов в DC (34), предполагая, что статус коллективной активации каждой индивидуальной MAPK определяет баланс между про — и противовоспалительные реакции ДК. Поскольку SHP-1 модулирует передачу сигналов MAPK в лимфоцитах и ​​макрофагах (13, 16), а SHP-1 ингибирует LPS-индуцированную продукцию цитокинов BMDC (рис. 1 E – G ), мы исследовали роль SHP-1 в TLR4- индуцированная активация MAPK в DC.Необработанные или обработанные SSG BMDC стимулировали LPS и анализировали на фосфорилирование ERK, JNK и p38. Как и ожидалось, стимуляция LPS в необработанных BMDC приводила к увеличению фосфорилирования всех трех MAPK. Хотя лечение SSG само по себе не изменяло базальное фосфорилирование ERK и JNK, стимуляция LPS в обработанных SSG BMDC приводила к увеличению кинетики фосфорилирования ERK и JNK (фиг. 2 C ). Напротив, базальные уровни p-p38 были снижены в BMDC, обработанных SSG, хотя стимуляция LPS действительно индуцировала фосфорилирование p38 с кинетикой, аналогичной необработанным клеткам.Это говорит о том, что в условиях покоя SHP-1 усиливает фосфорилирование p38 в DC, помогая поддерживать незрелый фенотип, который преодолевается стимулами, такими как LPS, которые управляют созреванием DC.

Чтобы идентифицировать белки-мишени SHP-1 в LPS-опосредованной передаче сигналов TLR4, мы экспрессировали HA-меченный WT-SHP-1 или HA-меченный субстрат, улавливающий мутант DN-SHP-1 в DC линии мыши D2SC / 1. После стимуляции LPS мы использовали антитело против НА для иммунопреципитации наших трансфицированных конструкций и искали тирозин-фосфорилированные мишени, которые дифференцированно коиммунопреципитировались с SHP-1.Хотя небольшое количество фосфорилированных по тирозину белков соосаждалось с WT-SHP-1 в отсутствие стимула, это базальное соосаждение было выше с DN-SHP-1, что позволяет предположить, что DN-SHP-1 действительно захватывает свои субстраты (рис. 2 D ). . В присутствии LPS несколько тирозин-фосфорилированных белков показали повышенное взаимодействие с WT-SHP-1, и это повышенное взаимодействие было заметно выше с DN-SHP-1. Чтобы идентифицировать некоторых из этих кандидатов, мы провели скрининг на белки, которые, как известно, участвуют в передаче сигналов TLR4 и чьи молекулярные массы соответствуют молекулярным массам LPS-индуцированных полос фосфотирозина после иммунопреципитации анти-HA (рис.2 D ). Мы наблюдали, что стимуляция LPS индуцировала взаимодействие SHP-1 с IRAK4 (фиг. 2 E ), но не с MAL / TIRAP, MyD88, SYK, VAV1, PYK2 или BTK (данные не показаны). Чтобы подтвердить это наблюдение, мы выполнили реципрокную иммунопреципитацию с анти-IRAK4 на LPS-стимулированных клетках и исследовали HA. Мы наблюдали, как и раньше, что SHP-1 соосаждался с IRAK4 (рис. 2 E ). Эти данные показывают, что LPS быстро индуцирует экспрессию белка SHP-1, предотвращая его протеасомную деградацию, а SHP-1, в свою очередь, подавляет активацию DC, отрицательно регулируя LPS-опосредованную передачу сигналов ERK и JNK и положительно регулируя базальное фосфорилирование p38.По крайней мере, один механизм, с помощью которого SHP-1 может модулировать передачу сигналов TLR4, связан с взаимодействием IRAK4 и дефосфорилированием.

SHP-1 ингибирует повышающую регуляцию CCR7 и индуцированную CCR7 миграцию DC

Созревание и миграция в LN в ответ на приобретение Ag DC в сочетании с сигналами иммунологической опасности необходимы для инициирования Т-клеточного ответа (3). Мы спросили, участвует ли SHP-1 в регуляции созревания DC, которое отмечено повышающей регуляцией костимулирующих рецепторов MHC и CCR7.BMDC обрабатывали LPS, SSG или обоими или оставляли без лечения, а экспрессию CD40, CD80, MHC класса II, CD54 и CCR7 определяли через 24 часа. Как и ожидалось, LPS увеличивал поверхностную экспрессию всех пяти рецепторов на BMDC по сравнению с необработанными клетками (фиг. 3 A , 3 B ). Ингибирование SHP-1 усиливало экспрессию CCR7, которая дополнительно индуцировалась в сочетании со стимуляцией LPS. Однако ингибирование SHP-1 не влияло на экспрессию CD40, CD80, MHC класса II и CD54.Чтобы исследовать механизм, с помощью которого SHP-1 влияет на экспрессию CCR7 в DC, мы измерили уровни мРНК CCR7 после ингибирования SHP-1 отдельно или в сочетании со стимуляцией LPS. Одно только ингибирование SHP-1 не изменяло уровни мРНК CCR7 в BMDC по сравнению с необработанными клетками (фиг. 3 C ). Транскрипция CCR7 индуцировалась LPS, но комбинация ингибирования SHP-1 и LPS не изменяла уровни сообщений CCR7 по сравнению с одним LPS. Эти данные предполагают, что хотя LPS регулирует экспрессию CCR7 путем индукции транскрипции, регуляция с помощью SHP-1, вероятно, происходит с помощью посттранскрипционного механизма.

РИСУНОК 3.

Влияние SHP-1 на созревание и миграцию постоянного тока. A , Экспрессия маркера созревания на CD11c ⁺ BMDC, обработанных SSG, 1 мкг / мл LPS или обоими или оставленными без лечения в течение 24 часов. Гистограммы представляют собой BMDC от одной из шести мышей. B , экспрессия CCR7 на CD11c ⁺ BMDC, обработанных SSG, LPS или обоими или оставленными без лечения в течение 24 часов. Данные представляют собой объединенное среднее значение ± стандартная ошибка среднего для шести экспериментов. Статистическую значимость определяли с помощью непарного теста Стьюдента t . C , анализ мРНК CCR7 из необработанных или BMDC, обработанных SSG, 1 мкг / мл LPS или обоими как кратное изменение по сравнению с необработанными BMDC. Данные представляют собой объединенное среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов. D , Трансвелл-анализ миграции in vitro для определения общего количества обработанных SSG или необработанных BMDC, мигрировавших в присутствии или в отсутствие CCL21 ( n = 4) вместе с CCR7-нейтрализующим Ab (анти-CCR7) или изотипическим контролем (ISO). E , индекс миграции BMDC, рассчитанный делением общего количества клеток, мигрировавших в присутствии CCL21, на общее количество клеток, мигрировавших в отсутствие CCL21.Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из четырех объединенных экспериментов ( n = 4). Статистическую значимость определяли с помощью непарного теста Стьюдента t . F , Анализ миграции in vivo, выполняемый путем инъекции меченных CFSE, немодифицированных или обработанных SSG BMDC в подушечки лап мышей WT. Через 24 часа после инъекции BMDC подколенные LN и соответствующие подушечки лап были удалены, и суспензия отдельных клеток была приготовлена ​​и проанализирована с помощью проточной цитометрии. Данные представляют девять мышей в группе, полученные в результате двух независимых экспериментов ( n = 9).Непарный тест Стьюдента t использовали для определения статистической значимости.

Поскольку ингибирование SHP-1 индуцировало уровни белка CCR7, мы спросили, играет ли SHP-1 роль в миграции DC в LN. Две линии доказательств предполагают, что SHP-1 может участвовать в CCR7-опосредованном хемотаксисе DC. Во-первых, SHP-1 может дефосфорилировать фактор обмена нуклеотидов VAV1 (35), который передает сигналы ниже CCR7 (36). Во-вторых, наши данные показывают, что SHP-1 ингибирует CCL21-индуцированную передачу сигналов CCR7, что приводит к экспрессии IL-6 в BMDC (дополнительный рис.2 А ). Чтобы проверить, влияет ли SHP-1 на CCR7-опосредованный хемотаксис DC, мы сначала выполнили тесты миграции in vitro с использованием CCL21 в качестве хемотаксического агента. Ингибирование SHP-1 увеличивало CCL21-индуцированный хемотаксис BMDC примерно в 2 раза (фиг. 3 D , 3 E ). Это усиление CCL21-индуцированной миграции BMDC посредством ингибирования SHP-1, а также базальной CCL21-индуцированной миграции BMDC ингибировалось CCR7-нейтрализующим Ab, но не изотипическим контролем. Это демонстрирует, что наблюдаемая миграция действительно опосредована CCR7.Чтобы определить, является ли повышенная экспрессия CCR7 на DC физиологически релевантной, мы изучили эффект ингибирования SHP-1 на миграцию DC in vivo. BMDC метили CFSE, обрабатывали SSG и вводили в подушечки задних лап мышей WT. Через 24 часа после инъекции подколенные узлы удаляли и исследовали на наличие клеток, меченных CFSE. Ингибирование SHP-1 в BMDC привело к значительному (> 4-кратному) увеличению их миграции в дренирующие LN по сравнению с отсутствием ингибирования SHP-1 (рис.3 F ). В соответствии с их усиленной миграцией LN, меньшее количество SHP-1-ингибированных BMDC остается в подушечках лап по сравнению с необработанными BMDC. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что SHP-1 играет ингибирующую роль в экспрессии CCR7 и может регулировать CCR7-опосредованную миграцию in vitro и in vivo.

SHP-1 ингибирует выживание DC и активацию AKT

DC представляют собой окончательно дифференцированные клетки с ограниченной продолжительностью жизни. Чтобы вызвать Т-клеточные ответы, им необходимо представить приобретенный Ag в LN в течение достаточного периода времени (37).Дефицит SHP-1 улучшает выживаемость Т- и В-клеток у мышей me, ^v / me ^v (7), предполагая, что SHP-1 может регулировать выживаемость DC. Чтобы проверить эту гипотезу, BMDC поддерживали в минимальной сывороточной среде, свободной от фактора роста, в присутствии или в отсутствие SSG и анализировали на выживаемость в течение 2 недель путем окрашивания аннексином V. BMDC, обработанные SSG, показали повышенную выживаемость по сравнению с необработанными клетками (фиг. 4 A , 4 B ). Увеличение выживаемости BMDC, ингибируемых SHP-1, было эквивалентно увеличению выживаемости, наблюдаемому в присутствии LPS в течение первых 7 дней, но ингибирование SHP-1 увеличивало выживаемость BMDC значительно по сравнению с лечением LPS на 12 день (рис.4 А ). В дополнение к ингибированию SHP-1 с помощью SSG, мы наблюдали, что уменьшение SHP-1 в BMDC с помощью shRNA Ad5-SHP-1 снижает гибель клеток в течение 72-часового периода времени по сравнению с обработкой контрольной shRNA, зашифрованной с помощью Ad5 (фиг. С ). В этих экспериментах лечение одним аденовирусом вызывало повышенную гибель клеток по сравнению с необработанными BMDC, что уже отмечалось ранее (38). В целом эти результаты показывают, что в DC SHP-1 является ингибитором выживания.

РИСУНОК 4.

SHP-1 подавляет выживание DC и активацию AKT. A и B , Выживание необработанных, обработанных SSG или 1 мкг / мл LPS BMDC, измеренное путем окрашивания аннексином V. График ( A ) представляет собой среднее значение ± SEM объединенных данных из трех отдельных экспериментов ( n = 3). Непарный тест Стьюдента t использовали для определения статистической значимости. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,005. B показывает типичные гистограммы проточной цитометрии одного из трех экспериментов, показанных в A . C , Выживаемость необработанных, обработанных Ad5-SHP-1 shRNA или обработанных Ad5 shRNA BMDC, измеренная с помощью окрашивания аннексином V. Данные представляют два отдельных эксперимента. D , Иммуноблот-анализ активации AKT в необработанных BMDC или обработанных SSG BMDC, стимулированных 1 мкг / мл LPS, как указано. Готовили лизаты и исследовали на p-AKT (T308 и S473). Те же блоты удаляли и повторно зондировали на общий белок. Разделительные линии указывают на разные части одного и того же геля. Лизаты необработанных BMDC или обработанных SSG BMDC, стимулированных 1 мкг / мл LPS, также исследовали на p-PDK1 и контроль нагрузки (β-актин).Все блоты представляют результаты двух-трех независимых экспериментов.

Хотя выживанию DC может способствовать активация NF-κB и MAPKs (33), путь AKT играет важную и неизбыточную роль в обеспечении выживания DC (39). В Т-клетках SHP-1 может дефосфорилировать активатор AKT PI3K (40). В других системах SHP-1 может дефосфорилировать и активировать фосфатазу и гомолог тензина, тем самым позволяя ему ингибировать активацию PI3K (41). Таким образом, мы предположили, что ингибирование SHP-1 может увеличивать выживаемость DC за счет активации AKT.Чтобы изучить активацию AKT, мы исследовали его фосфорилирование в T308 и S473 в лизатах BMDC, стимулированных LPS в присутствии или в отсутствие ингибирования SHP-1. Ингибирование SHP-1 привело к увеличению кинетики LPS-индуцированного фосфорилирования AKT как на T308, так и на S473 (фиг. 4 D ). Поскольку PDK1 является вышестоящей киназой, ответственной за фосфорилирование AKT T308, мы измерили активацию PDK1 (аутофосфорилирование его петли активации на S244) в тех же лизатах. Базальное и LPS-индуцированное фосфорилирование PDK1 (S244) усиливалось ингибированием SHP-1 (рис.4 D ). Эти данные показывают, что SHP-1 ингибирует выживание DC, и этот эффект SHP-1, по крайней мере частично, обусловлен ингибированием активации AKT.

Ингибирование SHP-1 усиливает стимуляцию Т-клеток DC

Наблюдая, что SHP-1 влияет на передачу сигналов DC, продукцию цитокинов, миграцию и выживаемость, все функции, которые влияют на примирование Т-клеток с помощью DC (4), мы исследовали функциональные последствия ингибирования SHP-1 на Т-клеточные ответы. Чтобы определить влияние ингибирования SHP-1 на DC-индуцированную пролиферацию Т-клеток, мы первоначально провели эксперименты по сокультуре DC: T-клеток in vitro, в которых трансгенные Т-клетки OT-1 (специфичные для K ^b -OVA) использовали в качестве респондеров. и необработанные BMDC или обработанные SSG BMDC использовали в качестве стимуляторов.Импульсные необработанные BMDC с одним пептидом OVA индуцировали пролиферацию клеток OT-1 (фиг. 5 A ), тогда как пульсирующие BMDC с TRP-2, не относящимся к делу пептидом для респондеров OT-1, не вызывали пролиферации. Когда BMDC обрабатывали SSG и пептидом OVA, пролиферация клеток OT-1 усиливалась при более низких соотношениях DC: T-клетки, чем наблюдали в необработанных BMDC с OVA (фиг. 5 A ). Мы повторили эти эксперименты с использованием BMDC, трансдуцированных Ad5-DN-SHP-1, и получили сопоставимые результаты (рис. 5 B ).Эти наблюдения демонстрируют, что SHP-1 ингибирует способность DC индуцировать пролиферацию Ag-специфических Т-клеток.

РИСУНОК 5.

SHP-1 ингибирует DC-индуцированные Т-клеточные ответы. A и B , Анализы пролиферации Т-клеток in vitro, выполняемые с использованием SSG, обработанного импульсным пептидом OVA или TRP-2 (SSG) ( A ) и Ad5-DN-SHP-1 (DN-SHP-1) — или Ad5-Luciferace (Luc) -трансдуцированные или необработанные BMDC дикого типа в качестве клеток-стимуляторов ( B ). Эти клетки совместно культивировали со спленоцитами респондеров ОТ-1 с последующим измерением включения тимидина.Планки погрешностей представляют собой SEM между повторами в одном и том же эксперименте. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. C – F , Т-клеточные ответы, измеренные у мышей дикого типа, вакцинированных i.p. с носителем (PBS) или TRP-2-импульсными Ad5-SHP-1 shRNA-, Ad5-scrambled shRNA- или Ad5-CMV-empty — трансдуцированными BMDC. Через одну неделю после вакцинации спленоциты были проанализированы на IFN-γ-продуцирующие CD8 ⁺ Т-клетки ( C ), IFN-γ-продуцирующие CD4 ⁺ T-клетки ( D ), Foxp3-экспрессирующие CD4 ⁺ T клетки ( E ) и TRP-2-специфические CD8 ⁺ Т-клетки ( F ) с помощью проточной цитометрии. F — репрезентативные данные для одной из пяти мышей. Односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом HSD Тьюки-Крамера был использован для определения статистической значимости в C – E , где n = 2–7 мышей / группа, как представлено отдельными точками данных. Группы, отмеченные одинаковыми символами (* или #), статистически отличались друг от друга с p ≤ 0,05.

Затем, чтобы изучить влияние SHP-1-ингибированных DC на Т-клеточные ответы in vivo, мышей WT вакцинировали TRP-2-импульсными BMDC, трансдуцированными кшРНК Ad5-SHP-1, контрольной кшРНК, скремблированной с помощью Ad5, или пустой вектор (Ad5-CMV-empty).Через одну неделю после вакцинации селезенки собирали, спленоциты стимулировали PMA и иономицином и анализировали внутриклеточный IFN-γ или Foxp3 в клетках CD3 ⁺ . Мы наблюдали значительное увеличение доли продуцирующих IFN-γ Т-клеток CD8 ⁺ у мышей, вакцинированных Ad5-SHP-1 shRNA-трансдуцированных BMDC, по сравнению с мышами, вакцинированными BMDC, обработанными только носителем (рис. ). Не было обнаружено различий в пропорции продукции IFN-γ Т-клетками CD8 ⁺ от мышей, вакцинированных носителем или контрольным вектором (рис.5 С ). Кроме того, мышей, вакцинированных BMDC, трансдуцированных Ad5-SHP-1 shRNA, показали значительную долю продуцирующих IFN-γ Т-клеток CD4 ⁺ (фиг. 5 D ). Соответственно, мы наблюдали значительное снижение экспрессии Foxp3-экспрессирующих CD4 ⁺ Т-клеток у мышей, вакцинированных BMDC, трансдуцированных Ad5-SHP-1 shRNA, по сравнению с мышами, вакцинированными BMDC, трансдуцированными Ad5-CMV-empty (рис. 5 ). E ). Никаких значительных изменений в экспрессии IL-17 или IL-4 в Т-клетках CD4 ⁺ не наблюдалось ни в одной из групп лечения (данные не показаны).Наконец, мы проанализировали индукцию TRP-2-специфической пролиферации Т-клеток CD8 ⁺ . Мы видели, что мыши, вакцинированные Ad5-SHP-1 shRNA-трансдуцированными BMDC, индуцировали в 6-12 раз более высокую пролиферацию TRP-2-специфических Т-клеток CD8 ⁺ , чем мыши, вакцинированные контрольным вектором или BMDC, обработанные носителем ( Рис.5 F ). Эти данные демонстрируют, что дефицит SHP-1, присущий DC, приводит к усилению пролиферации T-эффекторов CD4 ⁺ и Ag-специфических CD8 ⁺ и соответствующему снижению пролиферации регуляторных T-клеток.

Ингибирование SHP-1 в ДК повышает их эффективность в качестве противоопухолевых вакцин

За последнее десятилетие способность ДК индуцировать Ag-специфические иммуногенные Т-клеточные ответы использовалась в клиниках в испытаниях противоопухолевой иммунотерапии на основе ДК для нескольких типов рака, включая рак простаты и меланому (42, 43). В этих клинических испытаниях ДК показали многообещающую способность вызывать целевые, длительные иммунные ответы. Однако регресс опухоли наблюдается редко. Среди других стратегий исследования показали, что эффективность противоопухолевых вакцин на основе ДК может быть улучшена путем улучшения состояния активации или выживаемости ДК (20, 39, 42).Это требует исследования дальнейших стратегий повышения иммуногенности вакцины на основе DC.

Поскольку наши первоначальные исследования продемонстрировали, что SHP-1 функционирует в основном как ингибирующая молекула в DC, а ингибирование SHP-1 усиливает продукцию провоспалительных цитокинов DC, выживаемость, миграцию и ответы стимуляции Т-клеток, мы исследовали, ингибируют ли SHP-1 DCs могут усилить вакцины против неиммуногенной мышиной меланомы B16F10 и моделей рака простаты TRAMP-C2.Мышей с предварительно установленными эктопическими опухолями вакцинировали BMDC, трансдуцированными Ad5-SHP-1 shRNA, контрольными BMDC, трансдуцированными shRNA Ad5, или только носителем. Мы наблюдали значительно более медленный рост опухоли у мышей, вакцинированных Ad5-SHP-1 shRNA-трансдуцированных BMDC, по сравнению с мышами, вакцинированными контрольными группами в обеих моделях опухолей (фиг. 6 A , 6 C ). Сходные результаты наблюдались у мышей с меланомой B16, вакцинированных экспрессирующими DN-SHP-1 BMDC (фиг. 6 B ).Кроме того, у мышей, несущих меланому B16, соответствующее увеличение выживаемости наблюдалось у мышей, вакцинированных BMDC, трансдуцированных Ad5-SHP-1 shRNA (данные не показаны). Эти эксперименты демонстрируют, что ингибирование SHP-1 в DC может улучшить их эффективность in vivo в качестве противоопухолевых вакцин.

РИСУНОК 6.

ДК, ингибированные SHP-1, являются эффективными противоопухолевыми вакцинами. A , Рост опухоли у мышей, несущих опухоль B16, вакцинированных TRP-2-импульсными кшРНК Ad5-SHP-1 или скремблированными кшРНК Ad5 BMDC или только носителем.Для всех групп n = 5. * p ≤ 0,05 и ** p ≤ 0,01 между объемами опухолей в группе BMDC, трансдуцированной Ad5-SHP-1 shRNA, и BMDC, трансдуцированной с помощью Ad5-scrambled shRNA. -вакцинированная группа. Данные представляют собой три независимых эксперимента с аналогичными результатами. B , Рост опухоли у мышей WT, несущих опухоль B16, вакцинированных TRP-2-импульсными Ad5-DN-SHP-1- или Ad5-CMV-empty-трансдуцированными BMDC, немодифицированными BMDC или только носителем. Для всех групп n = 5.* p ≤ 0,05 между объемами опухолей в группе, вакцинированной BMDC, трансдуцированной Ad5-DN-SHP-1, и в группе, вакцинированной немодифицированным BMDC. C , Рост опухоли у WT-мышей, несущих опухоль TRAMP-C2, вакцинированных импульсными ад5-SHP-1 shRNA с лизатом TRAMP-C2 или скремблированными ксРНК Ad5 BMDC или только носителем. Для всех групп n = 5. * p ≤ 0,05 между объемами опухолей группы, вакцинированной BMDC, трансдуцированной Ad5-SHP-1, и группы, не вакцинированной Ad5. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами.

Обсуждение

Наши результаты показывают, что SHP-1 является внутренним центральным регулятором сигнализации и функции постоянного тока. Мы показываем, что SHP-1 ингибирует активацию DC, TLR4, передачу сигналов цитокинов и хемокиновых рецепторов, выживание и миграцию LN. Таким образом, ингибирование SHP-1 в DC увеличивает их общую активацию и выживаемость, что приводит к их повышенной способности стимулировать пролиферацию Ag-специфических Т-клеток и эффекторную функцию.

В большинстве функциональных исследований SHP-1 на сегодняшний день использовались глобальные SHP-1-дефицитные мыши me / me или me ^v / me ^v мышей (8, 11, 14).Наш анализ BMDC me ^v / me ^v показал, что они дефектны по экспрессии и индукции MHC класса II, и когда me ^v / me ^v BMDC использовались в качестве вакцин, это функциональный дефект не смог вызвать противоопухолевый иммунный ответ (данные не показаны). Поскольку мы не наблюдали подобный дефект MHC класса II в SHP-1-ингибированных BMDC WT, наблюдаемый фенотип BMDC me, ^v / me ^v , вероятно, задействует внешние компенсаторные механизмы DC в ответ на гиперактивацию лимфоцитов.Подобный дефект MHC класса II наблюдался на BMDC от парных мышей с дефицитом Ig-подобного рецептора-B (PIR-B) (44), которые проявляют аутоиммунитет в результате гиперактивации B-клеток. Хотя PIR-B передает сигналы через SHP-1, снова неясно, является ли наблюдаемый фенотип BMDC внутренним или внешним DC. Поэтому, чтобы преодолеть недостатки использования системы me, ^v / me ^v , мы использовали альтернативные стратегии ингибирования SHP-1 в нормальных для развития BMDC, включая использование 1) DN-SHP-1, 2) SHP-1-специфическая shRNA и 3) низкомолекулярный ингибитор SHP-1 SSG.Важно отметить различия в механизме ингибирования SHP-1 этими стратегиями, поскольку недавние исследования показали, что SHP-1 имеет независимые от фосфатазы функции (13). Хотя DN-SHP и SSG действуют путем ингибирования каталитической функции SHP-1 (28), shRNA SHP-1 снижает экспрессию белка SHP-1. Используя несколько стратегий ингибирования SHP-1, мы показываем, что SHP-1 негативно регулирует активацию DC NF-κB и AP-1 и продукцию цитокинов DC, указывая на то, что активность фосфатазы SHP-1 необходима для этих функций.Дополнительным преимуществом использования нескольких стратегий ингибирования SHP-1 является устранение потенциальной нецелевой активности SSG, который является высокоэффективным необратимым ингибитором активности SHP-1 (99%) в используемой дозе (10 мкг / мл), но также может частично ингибируют SHP-2 и PTP1B в той же концентрации (26).

Хотя LPS-триггерная передача сигналов TLR4 может приводить к активации DC посредством множественных сигнальных путей, индуцируются ингибирующие молекулы, которые ограничивают эту активацию как механизм отрицательной обратной связи (31).В этой статье мы показываем, что SHP-1 является одной из таких ингибирующих молекул, которая быстро индуцируется передачей сигналов TLR4 в DC. Хотя мРНК и белок SHP-1 могут быть индуцированы этими и другими стимулами в течение 4 часов (45), мы показали, что LPS индуцирует стабилизацию белка SHP-1 быстро (в течение 5 минут) путем ингибирования его протеасомной деградации, а не индукции мРНК. Высокий оборот белка SHP-1, опосредованный протеасомой, был недавно продемонстрирован и другими исследователями, где обработка MG132 быстро индуцировала экспрессию SHP-1 (46).

SHP-1 участвует в LPS-отрицательной обратной связи в DC не только путем ингибирования NF-κB и AP-1, но также путем модуляции активации MAPK. Мы показали, что SHP-1 ингибирует активацию ERK1 / 2 и JNK, одновременно способствуя активации p38 в DC. Наши результаты отличаются от результатов An et al. (13) где SHP-1-дефицитные DC демонстрируют повышенную LPS-индуцированную активацию p38. Мы считаем, что это несоответствие связано с различиями в методологии. An et al. (13) использовали BMDC, полученные из me, ^v / me ^v , для изучения эффектов стимуляции LPS на передачу сигналов SHP-1.В наших экспериментах мы использовали WT-BMDC, сывороточный голод и инкубировали в течение 16 часов в SSG перед воздействием LPS. По нашему опыту, BMDC me ^v / me ^v значительно менее чувствительны к LPS, чем BMDC WT, ингибированные для SHP-1 (I. Ramachandran, неопубликованные данные). Мы видим уменьшение базального p-p38 в момент времени 0 (рис. 2 C ) и такой же ход его индукции (начиная с 30 мин), как и у An et al (13). Мы интерпретируем это как означающее, что в условиях покоя SHP-1 усиливает фосфорилирование p38.Несмотря на противоречивую литературу о специфической роли MAPKs в DCs, большое количество доказательств указывает на то, что роли ERK и JNK в DCs важны для созревания DC, продукции провоспалительных цитокинов и выживания (32, 33). Хотя известно, что белки семейства p38 вносят вклад в продукцию IL-12 (47), избыток активности p38 ингибирует созревание DC и индуцирует противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β (34, 48). Мы показываем, что по крайней мере один механизм, с помощью которого SHP-1 может модулировать передачу сигналов TLR4, заключается в том, что вызывает дефосфорилирование IRAK4.IRAK4 незаменим в активации руки MyD88 передачи сигналов TLR4 (49). MyD88 привлекает IRAK, включая IRAK4 и IRAK1, что приводит к их фосфорилированию и ассоциации с TNFR-ассоциированным фактором-6. TNFR-связанный фактор-6 затем активирует расположенные ниже MAPK и NF-κB, активируя киназу киназы MAPK TAK1. Другие исследования показали, что SHP-1 может связывать IRAK1 через ITIM-подобный домен на IRAK1 (50, 51). Однако в IRAK4 этот домен отсутствует. Возможно, что SHP-1 рекрутируется IRAK1 в комплекс, содержащий IRAK4, который затем дефосфорилируется SHP-1.Хотя известно, что IRAK4 фосфорилируется по остаткам серина и треонина, наши данные предполагают, что IRAK4 также фосфорилируется по тирозину. Кроме того, мы показываем, что помимо IRAK4, есть несколько других тирозин-фосфорилированных мишеней SHP-1 в пути TLR4, над идентификацией которых мы в настоящее время работаем. Функция SHP-1 в пути TLR4 приводит к ингибированию TLR4-индуцированных цитокинов IL-12, IL-6 и IL-1β. Таким образом, SHP-1 является важным глобальным регулятором пути TLR4. В целом, наши данные показывают, что SHP-1 индуцируется стимулом TLR4 и может участвовать в передаче сигналов отрицательной обратной связи, чтобы ослабить активацию DC.

Помимо ингибирования цитокинов, индуцированных TLR4, SHP-1 регулирует продукцию TNF-α с помощью IL-4R и GM-CSFR. И GM-CSFR, и IL-4R передают сигналы через пути JAK / STAT, некоторые члены которых являются прямыми субстратами для SHP-1. Передача сигналов IL-4 приводит к активации STAT-6, который необходим для опосредованного IL-4 ингибирования продукции TNF-α (30, 52). Более того, было показано, что SHP-1 непосредственно ингибирует фосфорилирование STAT-6 (29, 53), предполагая, что это может быть механизмом, с помощью которого ингибирование SHP-1 усиливает опосредованное IL-4 ингибирование TNF-α.

Было показано, что в отличие от IL-4R, стимуляция GM-CSF индуцирует экспрессию TNF-α (54, 55). Один из известных механизмов, с помощью которого это происходит, — это активация STAT3, индуцированная GM-CSFR, которая, в свою очередь, связывается с промотором TNF-α и индуцирует его (56). Несколько исследований показали, что STAT3 и проксимальная киназа JAK2 GM-CSFR являются прямыми субстратами для SHP-1 (45, 57, 58). Таким образом, мы полагаем вполне вероятным, что усиление индуцированной GM-CSFR продукции TNF-α в DCs опосредуется по крайней мере частично увеличением фосфорилирования JAK2 и STAT3, когда SHP-1 ингибируется.

LPS сильно индуцирует продукцию TNF-α в BMDC (рис. 1 E ) на уровнях от 2 до 3 нг / мл. Передача сигналов LPS через TLR4 может управлять экспрессией TNF-α за счет активации сайтов связывания NF-κB, IFN-регуляторного фактора-3 и AP-1, все из которых присутствуют в промоторе TNF-α (59). Наблюдение, что ингибирование SHP-1 не увеличивает и без того высокие уровни TNF-α (> 10 раз превышающие уровни, индуцированные GM-CSF), в сочетании с тем фактом, что существует по крайней мере три пути, через которые TLR4 может управлять TNF -α, предполагает, что SHP-1 не может быть этапом, ограничивающим скорость.

CCR7-опосредованная миграция DC в LN имеет решающее значение для примирования ответов Т-клеток (3). Мы показываем, что SHP-1 также является негативным регулятором инициируемой CCL21 передачи сигналов CCR7, поскольку ингибирование SHP-1 привело к опосредованному CCL21 усилению LPS-индуцированного IL-6. CCR7 представляет собой рецептор, связанный с G-белком, экспрессируемый на созревших DC. SHP-1 может связывать и дефосфорилировать VAV1 (35), ключевую сигнальную молекулу, которая функционирует как цитоплазматический фактор обмена гуаниновых нуклеотидов для GTPases семейства Rho, обнаруженных ниже нескольких хемокиновых рецепторов (36).Дефосфорилирование VAV1 может объяснить наблюдаемый эффект SHP-1 на индуцированный CCR7 IL-6. Кроме того, мы показываем, что ингибирование SHP-1 увеличивает общие уровни белка CCR7 на BMDC за 24 часа; однако он не изменяет уровни мРНК SHP-1. Это предполагает, что SHP-1 регулирует экспрессию CCR7 в DCs посредством посттранскрипционного механизма. В других типах клеток SHP-1 может регулировать стабильность белков, способствуя их протеасомной деградации (60). Также возможно, что SHP-1 использует аналогичный механизм для посттранскрипционного ингибирования уровней белка CCR7.Функционально способность SHP-1 ингибировать передачу сигналов CCR7 и активацию белка приводила к снижению CCL21-зависимой миграции BMDC in vitro и уменьшению миграции подушечки стопы в LN BMDC in vivo. Взятые вместе, эти данные показывают, что SHP-1 является ключевым ингибитором регулируемой CCR7 миграции DC.

Хотя активация и созревание ДК определяют качество ответов Т-клеток, продолжительность жизни ДК определяет величину ответов Т-клеток (37), зрелые ДК считаются терминально дифференцированными с относительно короткой продолжительностью жизни (61).Выживанию DC может способствовать активация нескольких независимых сигнальных модулей, включая MAPK, NF-κB и путь PI3K / AKT (33, 39). Наши исследования показывают, что SHP-1 является ингибитором выживания DC. Хотя регуляция NF-κB и MAPKs может участвовать в механизме, с помощью которого SHP-1 ингибирует выживание DC, мы показали, что SHP-1 также ингибирует путь AKT в DC. Известно, что в лимфоцитах и ​​макрофагах SHP-1 ингибирует передачу сигналов AKT, напрямую ингибируя PI3K или способствуя активации фосфатазы и гомолога тензина (40, 41).В этой статье мы показали, что SHP-1 ингибирует LPS-индуцированное фосфорилирование AKT в BMDC как на S473, так и на T308. SHP-1 также ингибировал LPS-индуцированное аутофосфорилирование AKT T308 киназы PDK1, расположенной выше по течению. Взятые вместе, наши данные показывают, что SHP негативно регулирует выживаемость DC, воздействуя на пути выживания.

Хотя повышенная скорость миграции ДК в лимфатические узлы (рис. 3 F ) и их продолжительность жизни (рис. 4) могут способствовать усилению стимуляции Т-клеток ингибируемыми SHP-1 ДК in vivo, эти факторы, вероятно, не действуют. роль в наблюдаемом увеличении пролиферации Т-клеток, индуцированной SHP-1-ингибированными DC in vitro.Как видно на фиг. 3 A , CD40, MHC класса II, CD86 и ICAM-1 поверхностная экспрессия присутствует на некотором измеряемом уровне на BMDC даже в отсутствие какого-либо лечения. Хотя лечение SSG само по себе не увеличивает экспрессию этих белков, оно все же может влиять на способность DC стимулировать пролиферацию Т-клеток через изменения в среде цитокинов. Как показано на фиг. 1 E , ингибирование SHP-1 приводит к повышенной экспрессии IL-12, IL-1β и IL-6, каждый из которых, как известно, способен усиливать пролиферацию Т-клеток, управляемую TCR.Другие исследователи описали похожий феномен, когда BMDC, дефицитные по PIR-B, рецептору рекрутинга SHP-1, способны усиливать стимуляцию Т-клеток без увеличения экспрессии костимулирующих молекул на поверхности (13). Кроме того, мы не можем исключить, что дополнительные поверхностные белки или цитокины DC, которые мы не измеряли, также могут способствовать усилению стимуляции Т-клеток.

В целом, в этом исследовании мы показали, что SHP-1 негативно регулирует несколько функций DC, включая активацию, продукцию цитокинов, миграцию и выживание, все из которых значительно влияют на способность DC стимулировать ответы Т-клеток.Действительно, мы показываем, что SHP-1 ингибирует DC-индуцированную пролиферацию Т-клеток Ag-специфическим образом in vitro и in vivo. Кроме того, SHP-1 ингибирует DC-индуцированные Th2-ответы и IFN-γ-продуцирующие ответы CD8 ⁺ T, одновременно способствуя пролиферации Foxp3 ⁺ T-клеток. Эти наблюдения соответствуют SHP-1-ингибированным BMDC, ингибирующим рост опухоли в моделях мышиной меланомы B16 и TRAMP-C2 рака простаты. Одна вакцина из SHP-1-ингибированных ДК также увеличивала выживаемость мышей с опухолями.Таким образом, в качестве доказательства принципа мы показали, что ингибирование SHP-1 является эффективной стратегией повышения эффективности вакцин на основе DC против предварительно установленных опухолей. Эти данные предполагают, что манипулирование SHP-1 в DC потенциально может быть использовано в качестве платформы для улучшения вакцин не только против опухолей, но и против инфекционных заболеваний. Дальнейшее значение SHP-1 как центрального внутреннего регулятора функции DC заключается в возможности разработки методов повышения активности SHP-1, которые могут модулировать индуцированную DC толерантность и, таким образом, помочь контролировать аутоиммунные заболевания.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим М. Радда за предоставление конструкции шРНК, скремблированной с помощью Ad5, и С. Чиу за советы по экспериментальным процедурам.

Сноски

• Эта работа была поддержана грантами Министерства обороны W81XWH-07-1-0025 (для JML) и W81XWH-09-1-0371 (для IRR) и грантом Фонда гольфистов против рака (для JML).

• Онлайн-версия статьи содержит дополнительные материалы.

• Сокращения, использованные в этой статье:

  BMDC

  Дендритные клетки костного мозга

  DC

  дендритные клетки

  DN

  доминантно-отрицательные

  HA

  в гемоглобине IRA

  1R-ассоциированная киназа

  LN

  лимфатический узел

  me ^v / me ^v

  материнская жизнеспособная

  p

  фосфо-

  PDK1

  1-фосфоин-зависимый белок

  фосфоин-

  PDK1 -зависимый

  PIR-B

  парный Ig-подобный рецептор-B

  RNAi

  РНК-интерференция

  SFM

  бессывороточная среда RPMI 1640

  SHP-1

  Src область гомологии 2 домен-содержащий протеин тирозинфосфатаза-1

  shРНК

  короткая шпилька РНК

  SSG

  стибоглюконат натрия

  TRP-2

  тирозиназоподобный белок-2

  WT

  дикого типа.

• Получено 20 мая 2010 г.
• Принято 26 января 2011 г.

• Авторское право © 2011 Американской ассоциации иммунологов, Inc.

Краткое изложение действий для 186-го совещания WPRFMC

8 июня 2021 г. — Региональный совет по управлению рыболовством в Западной части Тихого океана опубликовал следующее:

1. Поправка к нормативным требованиям: Требования к приспособлениям и выпуску для улучшения послевкусия…..Выживание океанических белоперых акул при ярусном промысле
.
2. 2022 Территориальный предел вылова / усилия большеглазого тунца в США и требования к его распределению
3. Многолетние ограничения на вылов и отлов ярусного бигайя на территории США
4. План восстановления видов в подразделении по управлению донной рыбой в Американском Самоа
5. План охраны морской среды Американского Самоа
6. План восстановления видов на участке по управлению донным рыбным промыслом Гуама
7. Стандартизированная методология отчетности по прилову и поправки к FEP для обновления…..Согласованность
8. Годовые ограничения вылова донной рыбы на Главном Гавайском острове Глубокие 7 для промысловых лет 2021-23

Щелкните здесь, чтобы получить полную версию в формате PDF 186-й сводной записки по заданию.

186-е заседание Регионального совета по управлению рыболовством в Западной части Тихого океана состоится 22-24 июня 2021 года в форме веб-конференции (WebEx) с хост-сайтами в следующих местах:

• Здание Теди из Самоа, люкс 208B, деревня Фагатого, Американское Самоа
• Cliff Pointe, 304 W.O’Brien Drive, Хагатна, Гуам
• BRI Building, Suite 205, Kopa Di Oru St. Garapan, Saipan, CNMI

Ссылка WebEx: https://tinyurl.com/186CouncilMtg (при появлении запроса введите номер события: 133 181 5362; пароль: CM186mtg).

Совет рассмотрит и может принять меры по вопросам, кратко изложенным ниже, включая любые общественные комментарии по ним. Письменные комментарии общественности по вопросам окончательных действий должны быть получены исполнительным директором Совета до 17:00.