211440 lada: Купить LADA (ВАЗ) 2114 с пробегом: продажа автомобилей Лада 2114 б/у в Москве

LADA (ВАЗ) ЛАДА 211440 LADA SAMARA LADA 211440 LADA SAMARA 1,6 MT (81 лс) цвета сине-черный 2010 года выпуска VIN XTA21144*B4****67

LADA (ВАЗ) ЛАДА 211440 LADA SAMARA LADA 211440 LADA SAMARA 1,6 MT (81 лс)

Модель

LADA (ВАЗ) ЛАДА 211440 LADA SAMARA LADA 211440 LADA SAMARA

Привод

Передний

Цвет

сине-черный

Объем двигателя, куб.см.

1 600

Год выпуска

2010

Мощность, лс

81

Кузов

Хэтчбек 5 дв.

Тип топлива

Бензин

Состояние

Среднее

Владельцев по ПТС

три и более

Модификация

1,6 MT (81 лс)

Пробег, км

257 212

Обращаем Ваше внимание на то, что информация, размещенная на данном сайте, носит исключительно информационный характер и не является публичной офертой, определяемой положениями статьи 437 Гражданского кодекса Российской Федерации. Все изображения и фотографии, размещенные на данном сайте, выполняют иллюстративную функцию.

Примеры и фото шумоизоляции авто.

В нашем портфолио на сайте опубликовано более 100 работ, где мы пошагово рассказываем, как работали с конкретным автомобилем. Качественные фотографии и комментарии подтвердят наш профессионализм. Убедитесь сами!

всеAudi BMW Chery Chevrolet Datsun Ford Geely Great Wall Haval Hawtai Honda Hyundai Infiniti Jeep KIA Lada Lexus LIFAN Mazda Mitsubishi Nissan Renault Skoda Subaru Suzuki Tagaz Toyota Volkswagen УАЗ

все2 Series 2114 3 6 Accord Allion Almera Arkana ASX Aveo BB Boliger Camry XV40 Camry XV55 Camry XV70 Caravelle Ceed Ceratto Corolla E150 Corolla E170 Corolla E180 Cr-V 2 Cr-V 4 Cr-V 5 Creta CX-5 Duster Elantra Emgrand Fielder Fit Fit Shuttle Focus Forester SH Forester SJ Funcargo Fusion Fx-35 Fx37 Golf Grand Cherokee Grand Vitara Granta GS GX H5 H6 Highlander Hover i30 i40 IX35 Jade K5 Kalina Kaptur Karoq Kuga Lacetti Lancer Land Cruiser Largus LC Prado 120 LC Prado 150 Leaf Logan LX Montero Multivan Murano Z51 Murano Z52 Niva Note NX Octavia Odyssey On-do Optima Outback Outlander GF Outlander GT Outlander XL Pajero Pajero Sport Passat B8 Patriot Patriot Pickup Pilot Polo Mk5 Polo Mk6 Priora Prius Probox Q3 Q5 Qashqai J10 Qashqai J11 Ractis Rapid Rav4 XA30 Rav4 XA40 RAV4 XA50 Rio FB Rio JB Rio QB Rio QB Hatchback Rio X-Line RX Sandero Santa Fe Solano Solaris Sonata Sorento Sorento Prime Sportage Stepwgn Superb Tager Tahoe Teana Teramont Terrano Tiggo Tiguan Tiida Toureg Tucson Tundra Vesta Vitara X-Ray X-Trail T30 X-Trail T31 X-Trail T32 X60 XV Х70

Найдено вариантов: 229

Полная шумоизоляция

Уровень КОМФОРТ

Полная шумоизоляция

Уровень КОМФОРТ

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Полная шумоизоляция

Уровень КОМФОРТ

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень КОМФОРТ

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень ЭКСТРА

Полная шумоизоляция

Уровень ПРЕМИУМ

Хотите так же?

Отправьте заявку
на установку

Наш менеджер поможет подобрать
подходящий уровень шумоизоляции,
оценит работу и запишет
на удобное время.

Гарантия бережного
отношения к вашему
автомобилю

Всего 1 день
занимает
комплекс
работ по
установке

Бессрочная гарантия
на комплекс услуг

Другие примеры работ

Уровень Премиум

Уровень Комфорт

Уровень Комфорт

Уровень Комфорт

Обратите внимание!

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2114 (Samara2) (Лада 2114 (Самара2)) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2114 (Samara2) (Лада 2114 (Самара2)) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—Автомобиль рассматриваю изначально как средство для перемещения из пункта А в пункт Б. Естественно, данную функцию автомобиль выполнял, всегда выезжал, всегда доезжал. Но, как говорится, дьявол…

1

Автомобилем очень доволен!!! Впечатления самые лучшие! Машина для работы-трудяга. Прекрасно себя зарекомендовал на трассе.

1 комментарий

Отличная рабочая лошадка для наших дорог с учетом доступного сервиса.

2

Резвая и компактная — для города с пробками самое то! Влезет в любую щель, но внутри вполне комфортна, ноги в приборную панель не упираются даже у тех, кто ростом под 2 метра, полное ощущение, что…

31 комментарий

Отзыв написан для людей с чувством юмора. Людей на серьезных щах, фанатов кредитопомоек, кормящих животных и беременных детей просьба покинуть страницу. Итак, 2114, как и все самары 2-х поколений…

158 коментариев

Средний автомобиль. По комфорту ужас, надежность на самом деле неплохая

2

Авто для тех имеет уровень достатка ниже среднего-сделан добротно,смотрится очень даже не плохо и если за ним следить и ухаживать,беречь от небрежного и безмозглого обращения-будет служить долго и…Купил машину с рук у 50-летнего хозяина в 2010 году. С его слов, ездил по городу и на дачу. Фаркоп отсутствует. комплектация- классическая, без наворотов. После покупки заменил масла, фильтра, купил…

4

Своих денег с учётом цен на иномарки в данном сегменте, но ВАЗ 2114 (как не прискорбно) наверное стОит. Впечатления эксплуатации? Крайне сложные, смешанные… Ну какие могут быть впечатления? Да я ни…

1312 коментариев

отличная машина не прихотливая и надёжная.в данное время рассматриваю возможность покупки такой же машины так как моя пришла в негодность и не потому что плохая а по тому что мне её продали с…Адаптирована для эксплуатации в россии!!

8

это треш, брала чтобы без колес не остаться с пробегом "якобы" 82 т. км. в идеальном состоянии((((((((, у меня за два месяца владения осталось только капиталку двигателю сделать (во время…

1810 коментариев

отличный а/м маленький расход 5л трасса 6,5л город

13 комментария

Машина нравится. Практичная. Неприхотливая.

6

Добрый вечер! С удовольствием поделюсь своим мнением о моем ваз 2114 2013г выпуска. Пробег 27000т км. Легко управлять автомобилем, доступное обслуживание…

2

Брал машину по программе утилизации,в салоне стоила 288 000,это была комплектация люкс.до этого была 2109,2110 двигатели одни и те же,различие только у 2114 инжектор.

46 коментариев

Автомобиль для нищих или немножко больных на голову. Иногда помогает начинающим начать. Заменитель вьючного животного при натуральном хозяйстве.

2013 коментариев

Итак, получив права и ощутив непреодолимое желание бороздить просторы наших дорог, выбор был сделан молниеносно! Кто-то крутил пальцем у виска, кто-то насмехался над моим новым приобретением: ВАЗ 2114…

5

Брал новую с салона. Цвет белый-нравится. За 2 с половиной года при ежедневной эксплуатации(не в такси) поменял шаровые(заводские были практически без смазки) и провел ревизию стартера(бендекс визжит…

72 комментария

Купил автомобиль ваз 2114 в 2012г., по началу меня все устраивало, все было хорошо и нечего не ломалось, на первое ТО съездил к оф диллеру, но как только я проехал на ней 35000км начались мелкие…

33 комментария

Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Спрос на автомобили марки Lada на вторичном рынке падает

Спрос на покупку подержанных автомобилей модели Lada на вторичном рынке упал на 18% за отчетный период с января по май 2020 года по сравнению с аналогичным временем 2019 года. Всего было перепродано 420 625 единиц машин.

Самым продаваемым автомобилем, пользующимся наибольшей популярностью в России, стала Lada 2114. Статистические данные по перепродаже данной марки были опубликованы 23 июля 2020 года на сайте «Автостат Инфо».

Спрос среди автолюбителей на автомобиль Lada 2114 также снизился на 19% по сравнению с прошлым годом. Всего было перепродано 43 039 машин.

Падение продаж среди автомобилей Lada коснулось следующих моделей этой марки:

• На втором месте оказалась Lada 2107. Ее показатели составили — 24% по сравнению с перепродажами в первом полугодие 2019 года. Количество купленных автомобилей составило 34 829 шт.

• Третье место заняла марка Lada 2170. Продажи данной модели машин упали на 19,5%. Всего было приобретено 32 885 автомобилей.

• Четвертую строчку рейтинга продаж автомобилей марки Lada заняла модель Lada 2121. Покупка машин упала на 13%, по сравнению с 2019 годом, и составила 30 940 экземпляров.

• Замыкающее пятое место заняла модель Lada 2190 Granta. Ее показатели составили — 6%. Перепродано экземпляров — 29 158 шт.

Автопроизводитель с 21 июля 2020 года выпустил в продажу под брендом Lada внедорожник Niva.

Автомобили Lada, несмотря на сниженные показатели продаж, пользуются стабильным спросом у населения. Машины приобретают не только за полную стоимость, но и берут в кредит.

На рынке существует множество кредитных организаций, предоставляющих займ на покупку машины. Каждая компания имеет собственные условия, предъявляемые к будущему автовладельцу, для открытия ему кредитной линии.

Сервис «Кредит на авто» представляет собой онлайн-площадку, которая осуществляет быстрый поиск выгодного автокредита.

Преимуществом использования сайта является:

• нахождение выгодного решения не выходя из дома;

• быстрый поиск выгодных условий кредитования;

• калькулятор расчета стоимости кредита.

Сервис осуществляет поиск банка, филиал которого расположен в любом городе на территории России. Есть возможность одномоментно отправить заявку сразу в несколько кредитных организаций. На получения одобрения от банка требуется срок ожидания около часа, а выбор наиболее лучших условий кредитований делает покупку интересующего автомобиля выгодной.

Автосалон PLAZA

Infiniti JX JX35 3.5 CVT (265 л.с.) 4WD 2013

Lada (ВАЗ) Granta 1.6 MT (87 л.с.) 2019

BMW 5 серия 525d xDrive 2.0d AT (218 л.с.) 4WD 2015

Mitsubishi Outlander 2.0 CVT (146 л.с.) 4WD 2015

Kia Rio 1.6 AT (123 л.с.) 2015

BYD F3 1.5 MT (95 л.с.) 2011

Ford Mondeo 1.6 MT (120 л.с.) 2012

Audi Q7 3.0d AT (249 л.с.) 4WD 2015

Toyota Land Cruiser 4.5d AT (235 л.с.) 4WD 2011

Nissan X-Trail 2.5 CVT (171 л.с.) 4WD 2018

Двигатель ВАЗ 21114. Характеристика. Особенности двигателя.

Двигатель ВАЗ 21114-100026080.   Характеристика двигателя ВАЗ 21114.

Двигатель четырехтактный, с распределенным впрыском топлива, рядный, с верхним расположением распределительного вала. Система охлаждения двигателя — жидкостная, закрытого типа, с принудительной циркуляцией жидкости. Двигатель имеет комбинированную систему смазки: под давлением и разбрызгиванием.

Количество цилиндров: 4 Рабочий объем цилиндров, л: 1,596 Степень сжатия: 9,6 Номинальная мощность двигателя при частоте вращения коленчатого вала 5200 об/мин,: 60 кВт.-(81,6 л.с.) Диаметр цилиндра, мм: 82 Ход поршня, мм: 75,6 Число клапанов: 8 Минимальная частота вращения коленчатого вала , об/мин: 800-850 Максимальный крутящий момент при 3000 об/мин., Н*м: 125 Порядок работы цилиндров: 1-3-4-2 Октановое число бензина: 95(неэтилирован.) Система подачи топлива: Распределенный впрыск с электронным управлением. Свечи зажигания: А17ДВРМ, BPR6ES(NGK) Вес, кг: 112,0

ДВС ВАЗ 21114–00 (60 или 90) – Евро 2;

ДВС ВАЗ 21114–20 (50 или 62) – Евро 3;

ДВС ВАЗ 21114-70 (72) – Евро 4.

Двигатель ВАЗ 21114 может применяться для установки на автомобили ВАЗ Lada Kalina, ВАЗ 2108, 21083, 2109, 21093, 21099, 2113, 2114, 2115, 2110, 2111, 2112 и их модификациях.

Двигатель ВАЗ 21114 — это модифицированный вариант двигателя 2111. Целью модификации было увеличение объема ДВС до 1600 см куб.(2111 — 1500 см куб.) и повышение экологических показателей до требований европейских стандартов. Существует несколько вариантов комплектации. Двигатель 21114, в зависимости от комплектации, может соответствовать экологическим требованиям Евро 2, Евро 3, или Евро 4. Моторы комплектации ВАЗ 21114–00 (60 или 90) – Евро 2; ВАЗ 21114–20(50 или 62) – Евро 3; ВАЗ 21114-70(72) – Евро 4.

Следует отметить, что двигатель 21114 по конструкции основных узлов: блока, головки блока, распредвала, клапанных механизмов и кривошипно-шатунного механизма не отличается от модели 11183.

Был разработан новый блок цилиндров 21114-1002011-10. Конструктивно он отличается от блока цилиндров 2110 только высотой (смотреть «Блок цилиндров»). Для увеличения объема потребовалось увеличить высоту блока на 2,3мм. ( высота от оси коленчатого вала до верхней поверхности блока — 197,1мм). Крепежные отверстия для крепления головки блока выполнены с резьбой М12 x 1,25 мм. Номинальный диаметр цилиндров – 82 мм.

Установлен коленчатый вал 11183 -1005016. По посадочным местам он соответствует коленчатому валу 2112. Этот вал имеет увеличенный на 2,3 мм радиус кривошипа, по сравнению с валом 2112, это обеспечивает ход поршня в 75,6 мм. Вал имеет маркировку : на противовесе указана модель — «11183».

Маховик и шкив коленчатого вала используются от ВАЗ 2110.

Внимание!

В двигателе применяется шатунно-поршневая группа 2110.

Головка блока цилиндров получила индекс – «11180». Головка имеет увеличенную камеру сгорания (81мм.х50мм.).

На двигателе ВАЗ-21114 используется фазированный впрыск. Это отличает его от ДВС ВАЗ-2111 с попарно-параллельным впрыском топлива. Поэтому на таких двигателях устанавливается распределительный вал с индексом 2111. В этой модификации, на конце вала, имеется штифт для контроля положения вала датчиком фазы. Распределительный вал приводится во вращение зубчатым ремнем 2108-1006040-10.

Шкив 11183-1006020 распределительного вала имеет отличие от шкива ВАЗ-2111. На установленном шкиве метка для установки фаз газораспределения смещена на два градуса, по отношению к метке шкива 2111.

Выбор поликлинового ремня, для привода генератора и других навесных агрегатов, определяется согласно наличию таких же конструктивных особенностей, как и на двигателе ВАЗ 2111.

Ресивер двигателя ВАЗ 21114 изготовлен из пластмассы, и отличается формой от модели используемой на двигателе ВАЗ 2111.

Произведены изменения в топливной системе двигателя. Отсутствует возвратная топливная магистраль. Установлена рампа форсунок модели 1118-1144010.

Устанавливаться форсунки «SIEMENS» VAZ20734(желтые) или «BOSCH» 0280 158 022.

На двигателе приемная труба глушителя объединена с каталитическим нейтрализатором (катколлектор).

В системе охлаждения установлен термостат нового образца мод. 1118-1306010.

Применяется генератор 9402.3701 (80 А).

На двигателе ВАЗ-21114 применяется четырехвыводная катушка зажигания, вместо модуля зажигания, применявшегося на модели ВАЗ-2111.

Электронная система управления двигателем осуществляется контроллером М7.9.7. или «Январь» 7.2.

Что значит в комплектации двигателя 21114 указано сцепление 18?

На двигателе 11183 стоит сцепление от 2108, а на моторе 21114 сцепление 2112.

 

Стингер (Stinger) авто в Тольятти

Собственное производство.

Компания StinGer-auto располагает собственным производством, что позволят предложить нашим клиентам выхлопные системы с наилучшим качеством и низкой ценой.

    

 Опытные мастера контролируют каждый этап производства выхлопных систем StinGer, что позволяет нашим клиентам не сомневаться в приобретенных системах.

   

Мы работаем только с качественными материалами, что позволяет обходить наших конкурентов, которые экономят, и тем самым ухудшают технические показатели производимых изделий.

   

Наша продукция пользуется заслуженным уважением не только у любителей тюнинга, но и у спортивных команд, выступающих на соревнованиях различного уровня.

   

Доверие оказанное нашей продукции позволило получить признание по всей России и организовать собственную дилерскую сеть.

StinGer-auto

Лучший способ придать автомобилю эффектный внешний вид, сделать его стильным, заметным и гораздо более функциональным – профессионально выполненный тюнинг.

Благодаря использованию качественных запчастей для тюнинга, выпускаемых под марками «Stinger-auto» и «Razgon», даже скромное творение отечественной автопромышленности способно стать настоящим произведением искусства.

Обратившись в наш интернет магазин запчастей «Стингер-авто», приобрести всё необходимое для эксклюзивного тюнинга вы сможете по самой привлекательной цене. И не слишком важно, хотите вы сделать своё авто более спортивным и «агрессивным», придать ему прочности и надёжности за счёт обвесов и усиления каркаса или просто освежить дизайн машины и сделать её более эффектной – в любом случае нам есть что вам предложить!

Продажа запчастей — наш профиль!

Улучшить свой автомобиль и добавить ему немного «лошадок» желает большинство владельцев автомобилей. А главное, на что обращает внимание клиент при тюнинге своего автомобиля, это качество и цену необходимых запчастей, а также их доступность в плане доставки, так как многие запчасти для некоторых марок автомобилей зачастую трудно приобрести.

Наше производство

Интернет магазин запчастей «Стингер-авто» предлагает широчайший ассортимент запчастей для тюнинга отечественных автомобилей, произведённых компанией Стингер. Как прямые производители запчастей, мы не только предлагаем их по минимальной стоимости, но и гарантируем отличное качество производимой продукции.

Изготавливается продукция под маркой «Стингер-авто» в Тольятти, но мы готовы сотрудничать с клиентами из любого региона РФ.

Наши бренды

В интернет магазине «Стингер-авто» можно приобрести продукцию собственного производства, выпускаемую под марками «Стингер-авто», «Razgon».

Наши бренды включают широчайший ассортимент продукции, позволяющей улучшить динамику, управляемость, надёжность автомобиля.

Наш ассортимент

Полный каталог продукции, которую предлагает интернет магазин запчастей «Стингер-авто», включает огроное количество наименований.

В наш ассортимент входят запчасти для усовершенствования двигателя, кпп, тормозной, выхлопной, впускной систем, резонаторы, элементы трансмиссии, турбо запчасти и многое другое.

Почему выгодно покупать у нас

• Стингер-авто — прямой производитель деталей для тюнинга марок «Razgon» и «Stinger-auto». Поэтому именно у нас цены на запчасти будут наиболее демократичными.


• В нашей компании работают только опытные менеджеры, готовые предоставить детальные консультации по любой из представленных в каталоге запчастей.


• Под маркой Stinger выпускается широкий ассортимент запчастей для тюнинга отечественных машин, включая всеми любимые классические модели. В то же время и владельцы иномарок найдут у нас немало деталей, способных сделать машину более стильной, динамичной и долговечной.


• Хотя производится продукция по маркой Стингер-авто в Тольятти, доставка товара обеспечивается по всей территории РФ, причём наиболее удобный способ доставки выбирает именно покупатель. Клиенты из Тольятти могут самостоятельно забрать продукцию со склада компании.


• Сертифицированную продукцию от производителя компания Стингер-авто поставляет и в другие города России. Официальных дилеров компании вы можете посмотреть на нашем сайте в разделе «Дилеры».

Наконец, ещё одна причина, почему выгодно покупать у нас – отношение к заказчикам. Мы одинаково качественно и доброжелательно обслуживаем и крупных оптовых покупателей, и частных клиентов, обратившихся к нам.

Ознакомьтесь с каталогом на сайте компании – богатый ассортимент предлагаемой продукции и доступные цены на действительно качественные запчасти станут для вас приятным сюрпризом!

В каком году начали выпускать лад 2114

В каком году начали выпускать мод 2114

1. ВАЗ-2114 Самара-2 пятидверный хэтчбек Волжского автозавода, рестайлинговый вариант ВАЗ-21093, продолжение семейства под кодовым названием Самара-2. Модель отличается от предшественников оригинальным дизайном передней части с новыми фарами, капотом, облицовкой радиатора, бамперами и наличием молдингов.
   Представлен публике в 2001 году, серийный выпуск с апреля 2003 года.
   Внутри ВАЗ-2114 установили новую приборную панель (так называемую европанель), регулируемую рулевую колонку, рулевое колесо из десятого семейства, отопитель, передние стекла. На автомобиль устанавливается восьмиклапанный двигатель объемом 1,5 литра. (ВАЗ-2111) с распределенным впрыском топлива.
   Первый экземпляр ВАЗ-2114 был собран на заводском конвейере в октябре 2001 года.
   С 2007 года установлен новый 1,6-литровый восьмиклапанный двигатель (ВАЗ-11183) экологического класса Евро-3. на автомобиле модель получает индекс ВАЗ-21144.Отличительные особенности старого двигателя, катализатор не под днищем, а возле двигателя, на двигатель поставлена ​​пластиковая декоративная крышка, вместо алюминиевого ресивера установлена ​​пластиковая. Помимо нового двигателя, автомобиль получает новую приборную панель (в верхней части отсутствует бардачок, используется более жесткий материал, что увеличивает прочность, но также увеличивает вероятность постороннего шума), новую панель приборов с функция бортового компьютера (показывает температуру за бортом, напряжение в бортовой сети, текущее время и другие параметры).
   В 2008 году произошли небольшие изменения в стиле: вместо широких молдингов на двери поставили узкие двери.
   В 2009 году дочернее предприятие ОАО «АвтоВАЗ» ЗАО «Супер-Авто» модернизировало ВАЗ-2114, а именно поставило на автомобиль 16-клапанный двигатель объемом 1,6 л; Мощность автомобиля стала 89 лошадиных сил. С 16-клапанным двигателем модель автомобиля получает индекс 211440-24. Увеличились динамические характеристики автомобиля. Кроме двигателя поменяли подвеску, коробку передач, сцепление и тормоза.

   Данная модель оснащена 14-дюймовыми катушками на штампованных дисках.
   В 2010 году компания Супер-Авто подготовила к выпуску автомобиль с двигателем 16V объемом 1,6 литра от Lada Priory объемом 98 л. с участием. Эта модель получила индекс 211440-26.

2. С 2003 года

Анти-крысиный альбумин, биотин-поликлональное антитело, 21-1440

-анти-крысиный альбумин, биотин-поликлональное антитело, 21-1440 | ARP American Research Products, Inc.

Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Дополнительная информация

Название продукта	Анти-крысиный альбумин, поликлональные антитела к биотину
Фон	Определенная специфичность антитела направлена ​​на альбумин при тестировании с сывороткой крыс.При иммуноэлектрофорезе и двойной радиальной иммунодиффузии (Оухтерлони) с использованием различных концентраций антисыворотки против соответствующих концентраций иммуногена получают единственную характеристическую линию преципитина, которая показывает реакцию идентичности с линиями преципитина, полученными против сыворотки крысы и очищенного альбумина. В иммуноцитохимическом и иммуногистохимическом применении для обнаружения альбумина на клеточном и субклеточном уровне путем окрашивания соответствующим образом обработанных клеточных и тканевых субстратов; в методологии неизотопного анализа (например,грамм. ELISA) для измерения альбумина в сыворотке крови крыс или других жидкостях организма. На втором этапе необходимо использовать конъюгат авидина или стрептавидина по выбору пользователя. Этот иммуноконъюгат предварительно не разводится. Оптимальное рабочее разбавление каждого конъюгата должно быть установлено титрованием перед использованием. Следует избегать избытка меченых антител, поскольку они могут вызвать сильное неспецифическое фоновое окрашивание и помешать специфическому сигналу. Рабочие разведения для гистохимического и цитохимического использования обычно составляют от 1: 100 до 1: 500; в ELISA и сопоставимых анализах связывания не преципитирующих антител между 1: 5 000 и 1: 15 000.
Хост	Коза
Клон	Поликлональные
Иммуноген	Альбумин — стабильный небольшой полипептид с сильной антигенностью. Его молекулярная масса составляет около 69000. Он обладает высокой подвижностью при электрофорезе, проявляет макрогетерогенность, особенно в патологических условиях, и может связывать большое количество физиологических и нефизиологических молекул. Альбумин выделяют из сыворотки крови крыс путем последовательного осаждения и очищают с помощью ионообменной хроматографии и аффинной хроматографии.Полный адъювант Фрейнда используется на первом этапе процедуры иммунизации.
Реакционная способность	Крыса
Приложения	Дот-блот, ELISA, ICC, IHC, WB
Хранилище	2-8C для немедленного использования или при -20C (аликвота). Избегайте повторного замораживания и оттаивания
Использование по назначению	Только для исследовательских целей

Все продукты для исследований продаются ТОЛЬКО для лабораторных исследований и НЕ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЖИВОТНЫХ.Представленная информация считается точной; однако указанная информация и продукты предлагаются без гарантии или гарантии, поскольку конечные условия использования и вариативность обрабатываемых материалов находятся вне нашего контроля. Ничто из раскрытого здесь не может быть истолковано как рекомендация использовать наши продукты в нарушение каких-либо патентов. ARP American Research Products, Inc. не представляет свои продукты на рассмотрение регулирующим органом каким-либо государственным органом или другой организацией, и мы не проверяем их для клинического, терапевтического или диагностического использования, а также на безопасность и эффективность.Вы несете единоличную ответственность за то, чтобы способ использования продуктов соответствовал применимым законам, постановлениям и государственным политикам, а также за получение всех необходимых разрешений, прав интеллектуальной собственности, лицензий и разрешений, которые могут вам понадобиться в связи с вашим использованием. Ни при каких обстоятельствах ARP American Research Products, Inc. не несет ответственности за ущерб, косвенный, компенсационный, случайный или специальный, строгую ответственность или небрежность, нарушение гарантии или любую другую теорию, возникшую в результате использования продуктов, доступных от ARP American Research. Продукты, Inc.Ничто из содержащегося здесь не гарантирует, что использование продуктов не будет нарушать притязаний каких-либо патентов, касающихся самого продукта или его использования в сочетании с другими продуктами или в работе любого процесса. ARP American Research Products, Inc. отказывается от любых заявлений или гарантий любого рода, явных или подразумеваемых, включая, помимо прочего, любые подразумеваемые гарантии товарной пригодности или пригодности для конкретной цели, ненарушения прав или результатов, полученных в результате использования любого продукта, независимо от того, вытекает ли он из закона или иного закона, или в результате выполнения, деловых операций или использования торговли.

Есть вопросы?

Представитель службы поддержки ARP будет рад помочь!

ВАЗ 211440: технические характеристики

Современный автомобильный рынок разнообразен как никогда. Большинство крупных производителей создают десятки моделей, занимая самые узкие ниши в борьбе за придирчивого и крайне требовательного покупателя. В России очень много популярных отечественных автомобилей, вышедших из-под крыла АвтоВАЗа. В этой статье мы поговорим с вами об одной из моделей этой компании — ВАЗ-211440.Дизайн интерьера и экстерьера, управляемость, технические характеристики, возможности тюнинга — все это вы найдете ниже.

Редизайн

Эта модель сошла с конвейера в 2007 году (серийное производство оригинальной 2114 началось в апреле 2003 года), завоевав беспрецедентную популярность среди миллионов водителей. ВАЗ-211440 — 5-дверный хэтчбек, также известный под другим названием — Самара-2. Это модернизация ВАЗ-2109 (в простонародье — «девятка»). Большинство изменений коснулось передней части кузова, они существенно повлияли на внешний вид автомобиля.Выпуск модели стал продолжением тенденции, подразумевающей продажу «семейных» автомобилей, хорошо приспособленных для российских дорог. Последние, как известно, безупречным качеством не отличаются. Производство модификации ВАЗ-211440, фото которой представлены в нашей статье, продолжалось до декабря 2013 года.

За 10 лет выпуска (базовая версия 2114) Автомобиль стал одной из самых продаваемых моделей, когда-либо выходивших стены АвтоВАЗа. Автомобиль — лучший вариант семейного автомобиля для людей с ограниченным бюджетом.Стоимость его колеблется от 150 до 200 тысяч рублей. Кстати, изначально модель называлась ВАЗ-2114, но с 2003 года началось производство модификации с улучшенным двигателем и экологическим классом. Наш герой — потрясающая машина, сочетающая в себе хорошие технические характеристики, комфорт и дизайн. В 2013 году ему на смену пришла «Лада-Приора», которая также стала популярной.

Внешний вид автомобиля

Экстерьер автомобиля заслуживает больших похвал, хотя здесь нет ни малейшего намека на роскошь.Модель привлекает взгляд плавными линиями и довольно скошенной оптикой. Глядя на машину под разными углами, можно отметить, что конструкция ВАЗ-211440 выгодно отличается от предшественницы новым капотом, бампером, фарами и облицовкой радиатора. Дизайн автомобиля стал более европейским, напомнив некоторые модели Renault, Dacia и Opel. Эта адаптация к западным аналогам привлекла большое внимание потенциальных покупателей, которым эта машина сразу понравилась. Новые крылья и молдинги стали еще двумя элементами, претерпевшими заметные изменения.Что касается бампера, то он был немного приподнят относительно земли, чтобы машина могла ездить не только по городским улицам, но и по проселочным дорогам. Задняя часть кузова практически не изменилась.

Автомобиль ВАЗ-211440 стал намного более устойчивым и маневренным при движении, чему способствовала низкая посадка. Потрясающие аэродинамические качества позволяют уверенно чувствовать себя на дороге, что не может не радовать. Инженеры укомплектовали машину 14-дюймовыми колесами на штампованных дисках.Габариты не изменились со времен «девятки», составив 4,12 метра в длину, 1,65 в ширину и 1,4 в высоту.

Интерьер автомобиля

Как и в случае с внешним видом, салон нашей героини стал более изысканным, впечатляющим современным дизайном и оснащением. Конечно, западные конкуренты остаются далеко впереди, но цена у российской машины соответствующая. Несмотря на относительно дешевые материалы и жесткий пластик, находиться в машине приятно. Некоторые детали откровенно радуют глаз.В максимальной комплектации хэтчбек может похвастаться хорошей приборной панелью, бортовым компьютером, подогревом сидений, электростеклоподъемниками передних дверей, новой торпедой и системой обогрева. В общем, сделано очень много. Несмотря на использование в основном недорогих материалов, хорошая эргономика и стыковка панелей в интерьере сразу дает ощущение хорошего качества и продуманности каждой детали.

Бортовой компьютер отображает необходимый минимум полезной информации. Чувствуется, что разработчики задумались о шумоизоляции.Звуки мотора и окружающей среды теперь не так четко проникают в салон, что делает поездку более комфортной и приятной. Конечно, это диковинка для водителей, перешедших с младших моделей.

Автомобиль очень просторный, здесь легко разместятся пятеро взрослых. Задний ряд сидений имеет возможность складывания, что позволяет значительно увеличить объем багажника. Последнее особенно актуально при длительных поездках или перевозке крупногабаритных вещей. Наконец, двери машины оснастили специальным механизмом, который позволял открывать их почти на 90 градусов, что облегчало посадку и высадку.

ВАЗ-211440: технические характеристики, расход топлива и коробка передач

При анонсе модели никто не ожидал большого прорыва. У нас типичный бюджет с двигателем объемом 1,5 литра мощностью 82 лошадиные силы. Показатель мощности увеличился со времен предшественника, где он составлял 72 лошадиные силы. Изначально машина оснащалась 8-клапанным двигателем объемом 1,5 литра, но в 2009 году инженеры заменили эту деталь (модификации ВАЗ 211440-26 и 211440-24) на более производительную, поставив 16-клапанный бензиновый двигатель с том 1.6 литров. Мощность увеличена до 89 лошадиных сил.

В этой модели положение катализатора было смещено в сторону мотора. В «девятке» он располагался под днищем. Двигатель, в свою очередь, был облачен в декоративную крышку. Что касается трансмиссии, то автомобиль оснащен 5-ступенчатой ​​«механикой» и улучшенным сцеплением с дорогой. Ход трансмиссии прост и без особых усилий. Мотор тандем — коробка в целом неплохая. Расход топлива в городском цикле составляет менее 7 литров на 100 километров.Напоследок приведем цифры, характеризующие технические характеристики быстрого набора в ВАЗ-211440. Машина способна развивать 185 км / ч. Разгон до 100 км / ч достигается за 11 секунд, что для этого класса неплохо.

Control

Наверняка многих интересует вопрос: «Что это за машина в движении и как ею управлять?» Ответ достаточно предсказуем — лучше, чем у всех его предшественников. Автомобиль достаточно легко ведет себя на дороге.На крутые повороты он не входит, а траектория меняется не так резко и хаотично, как это наблюдалось у младших моделей. Набирая большую скорость, машина ведет себя предсказуемо, и обгон дается ей без особого труда, несмотря на слабую техническую составляющую.

Ямы приличных размеров, ямы, всевозможные неровности, трамвайные рельсы — все это сделано без скрипов, стуков и поломок. Подвеска плотная, в меру жесткая. Корпус не скрипит, и пластик тоже не издает раздражающих звуков.

Тюнинг автомобилей

Говоря о тюнинге автомобилей, необходимо учитывать множество тонкостей, возникающих в результате столь интересного процесса. Осуществляя тюнинг ВАЗ-211440, запчасти на которые не очень дорогие, нужно помнить о регламенте, требующем согласования с компетентными лицами. Прежде чем приступить к совершенствованию своего автомобиля, необходимо обратиться в органы ГИБДД, сделав им заявление, в котором говорится о планируемых изменениях в конструкции автомобиля.Это обязательный пункт, пренебрегая которым, можно получить немалый штраф. Далее чиновники выдают разрешение, содержащее условия оформления и выдачи документа, подтверждающего техническую безопасность транспортного средства. Если планируются глобальные изменения, требуется оценка специалистов, а также прилагаемая техническая документация.

По окончании технических работ владелец станка должен предоставить еще одно заключение, в котором необходимо указать все внесенные изменения, их объем и качество.Затем владелец автомобиля отправляет его на техосмотр, после чего данные фиксируются в регистрационных документах. Работы, как видите, много.

Тюнинг двигателя

Серьезно рассматривая вопрос тюнинга на такой автомобиль, как ВАЗ («Жигули») 211440, стоит отметить тот факт, что автомобиль отлично подходит для столь смелого начинания. Профессиональная модернизация позволит ему развивать сумасшедшую скорость, до 200 км / ч, а также подарит отличную управляемость. Эта модель готова к множеству тюнинговых пакетов, созданных с учетом разных потребностей и пожеланий.Если вы хотите «выжать» из машины максимум, для этого есть все возможности. Запчасти можно приобрести на авторынке и в специализированных магазинах. К счастью, таких функций много.

Одной из самых популярных модификаций является усовершенствованный двигатель, позволяющий значительно увеличить мощность базового мотора или полностью заменить его на спортивный аналог. Для небольшого тюнинга достаточно произвести перепрошивку блока управления, а также заменить несколько заводских деталей.После несложных действий производительность силового агрегата может увеличиться на 10-15%. Если вы хотите еще больше улучшить двигатель, вам необходимо поменять головку блока цилиндров, слить клапаны и установить новый механизм, распределяющий газ.

Для этих экстремалей существуют радикальные методы увеличения мощности мотора. Например, на двигатель ВАЗ-11440 можно поставить турбину или заменить старый коленчатый вал на спортивный вариант, имеющий увеличенный ход поршня. Последний обеспечит больший крутящий момент, увеличив производительность силового агрегата.Этот вариант довольно рискованный, поэтому решение нужно тщательно обдумать. Есть заводские модификации двигателя, примером которых может служить ВАЗ-211440 дв. 11183 с увеличенным крутящим моментом.

При настройке коробки передач необходимо заменить номер передачи. Основная передача и серия выбираются в зависимости от конкретных типов двигателей, о которых вам подробно расскажут в мастерских и магазинах. Самоблокирующиеся дифференциалы позволяют значительно увеличить передачу крутящего момента на колеса автомобиля, позволяя серьезно увеличить тягу «на низу» во время интенсивного набора скорости.

Модернизация подвески

Основная характеристика ВАЗ-211440 — хорошая подвеска, позволяющая без проблем передвигаться по дорогам России. Тем не менее, точная настройка усложнит задачу, для чего нужно приобретать качественные амортизаторы. Для уменьшения углов крена рекомендуется установить жесткие стабилизаторы поперечной устойчивости.

Не забывайте про колеса, если планируете тюнинг подвески. На первый план выходит визуальная составляющая. Для «четырнадцатого» существует широкий выбор литых дисков, доступных в различных специализированных магазинах и на рынках.

Улучшение внешнего вида

Ну а куда без экстерьера? Пожалуй, один из самых популярных элементов тюнинга, призванный улучшить внешний вид автомобиля — аэродинамический обвес. Автомобиль становится намного красивее и эффектнее, привлекая взгляды прохожих и других водителей. Бамперы, молдинги, зеркала заднего вида, спойлеры — вариантов тюнинга масса. Качественные детали стоят очень дорого, что следует учитывать. В некоторых случаях цена всех запчастей может превышать стоимость самой машины.ВАЗ-211440 2010 года выпуска сейчас стоит около 150 тысяч рублей. При этом только фары могут стоить 30-40 тысяч рублей. Самый эффектный дизайн достигается благодаря кропотливой работе инженеров, переделывающих кузов. Обычно последние заключаются в установке воздухозаборников на крышу и капот, установке спойлера и боковых бордюров, покраске отдельных деталей кузова и тому подобное.

Тюнинг салона

Последний вид тюнинга — модернизация салона.Большинство энтузиастов устанавливают на приборную панель светодиодную подсветку, которая выглядит очень стильно. Можно заменить сиденья на спортивные версии или на более удобные, изготовленные из качественных материалов. Еще один способ улучшить машину — загрузить в машину всевозможное оборудование. Акустическая система, GPS-навигатор, навороченный бортовой компьютер — все будет. Завершить тюнинг можно тонировкой стекол. Главное — не переборщить. Салон ВАЗ-211440 довольно консервативен и скучен, поэтому тюнинг пойдет автомобилю только на пользу.

И наконец

Российская автомобильная промышленность пользуется значительной популярностью на всем постсоветском пространстве. В каждом городе или селе можно найти десятки автомобилей, сошедших с конвейера Волжского завода. В этой статье мы рассказали об одной из модификаций ВАЗ-2114 — ВАЗ-211440, технические характеристики которой были немного улучшены относительно базовой модели. За всю историю завода эта машина стала одной из самых продаваемых благодаря удачному дизайну интерьера и экстерьера, а также хорошей мощности двигателя, позволяющей набирать больше скорости.Наличие множества пакетов для тюнинга только популяризировало автомобиль, который до сих пор пользуется значительным спросом на рынке.

p>

Кристаллические структуры рианодинового рецептора SPRY1 и доменов тандемных повторов выявляют критическую детерминанту связывания FKBP12

Структура домена RyR2 SPRY1

Мы решили кристаллическую структуру домена RyR2 SPRY1 мыши, кодируемого остатками 650-844 ( эквивалент остатков RyR1 кролика 639–833) с разрешением до 1,2 Å (Таблица 1, Рис. 2, Дополнительный Рис.2). Структура содержит две цепи в асимметричном блоке; поскольку они почти идентичны, весь анализ выполняется на цепи A. Структура выявляет несколько особенностей, не наблюдаемых в недавних исследованиях крио-ЭМ, которые основывались на моделях, основанных на гомологии (рис. 2b, c). Эти расхождения нельзя отнести к разным изоформам, потому что последовательность SPRY1 высококонсервативна среди всех трех изоформ RyR (Fig. 2d). Ядро конструкции состоит из двух антипараллельных β-листов. Область «крышки», также наблюдаемая для домена SPRY2, образует крышку над этим ядром.Вставка, создающая β-шпильку, выступающую из ядра, отличает SPRY1 от SPRY2. Этот «палец» выступает из ядра и стабилизируется консервативным остатком Trp713 в основании, которое образует точку привязки. Конформация этого пальца идентична в обеих молекулах асимметричной единицы, а его остатки высококонсервативны среди всех трех изоформ RyR (рис. 2d), указывая тем самым, что он играет функциональную роль, формируя якорную точку для других RyR доменов или вспомогательных белков. Домен SPRY2 содержит «петлю вставки», которая разрывает β-цепь, обычно наблюдаемую в других доменах SPRY, в двух половинах ¹¹ .Эта петля вставки не наблюдается в домене SPRY1. Итак, несмотря на очень похожую складку сердцевины, SPRY1 и SPRY2 разошлись за счет нескольких вставок, которые влияют на их общую форму (дополнительные рис. 3a, 4 и 5).

Таблица 1 Статистика сбора и уточнения данных. Рисунок 2: Кристаллическая структура домена SPRY1.

( a ) Два разных представления домена RyR2 SPRY1 мыши. β-нити обозначены голубым, а 3 спирали ₁₀ — светло-зеленым.«Палец», образованный β-шпилькой, направленной от сердечника, обозначен красным. Крышка, следующая за ядром, обозначена бежевым цветом. Позиции для мутаций, связанных с заболеванием, показаны черными палочками и помечены. Неструктурированные петли обозначены пунктирными линиями. ( b ) Наложение кристаллической структуры SPRY1 (цвета) и одной из моделей (белый цвет), предложенных на основе крио-ЭМ исследований (карта 3,8 Å). Выделены основные отличия. Участок из 15 остатков, содержащий сдвиг в регистре на две аминокислоты, выделен оранжевым цветом.( c ) График, показывающий среднеквадратичное отклонение (среднеквадратичное отклонение) на остаток для предложенных моделей SPRY1 от трех независимых крио-ЭМ-структур относительно кристаллической структуры. ( d ) Выравнивание последовательностей домена SPRY1 из RyR1, RyR2 и RyR3. Элементы вторичной структуры для структуры RyR2 SPRY1 указаны над последовательностью. Мутации, связанные с заболеванием, выделены в последовательности красным цветом. Субструктура «пальца» высоко консервативна среди всех трех изоформ.

Эта кристаллическая структура отличается от моделей, предложенных крио-ЭМ исследованиями. Даже для криоЭМ-структуры с самым высоким разрешением существует много различий (например, см. График RMSD на рис. 2c). Β-шпилька, образующая «палец», отсутствует и вместо этого была смоделирована как петля, лишенная вторичной структуры, указывающая в другом направлении (значения среднеквадратичного отклонения (среднеквадратичное отклонение)> 20 Å, рис. 2b, c) . Кроме того, имеется двухступенчатый сдвиг в регистре последовательности для двух петель и основной β-цепи, в результате чего получается r.m.s.d. значения ∼7 Å. Такие сдвиги в регистре нельзя объяснить различиями последовательностей между RyR1 и RyR2, поскольку домен SPRY1 является высококонсервативным (Fig. 2d). Хотя эти новые исследования крио-ЭМ являются значительным достижением в данной области, преждевременно предполагать правильность положения каждой аминокислоты в модели, даже если она основана на карте с самым высоким разрешением.

Структура тандемных повторов

Домены SPRY1 и SPRY2 разделены последовательно тандемными повторами, кодируемыми остатками RyR1 862-1054 («Repeats12»; рис.1). Мы решили кристаллическую структуру RyR1 Repeat12 с разрешением 1,5 Å (рис. 3), что показывает, что две его половины не симметричны. Каждый повтор состоит из двух α-спиралей и коротких одиночных β-цепей на каждом С-конце, которые собираются с образованием двухцепочечного β-листа. Однако Repeat2 также содержит дополнительный трехцепочечный β-лист, который нарушает симметрию. Этот лист формируется за счет своей первой α-спирали (α ₁ ’), которая значительно короче, чем соответствующая спираль в Repeat1 (α ₁ ).Β-лист заполняет пространство между Repeat1 и Repeat2 и обеспечивает дополнительные взаимодействия, включая солевой мостик между Arg1000 и Glu917 (Fig. 3a). Два повтора разделены необычной петлей из 30 остатков, которая полностью структурирована. Эта петля образует большую U-образную крышку («U-крышку»), которая тесно взаимодействует с α-спиралями Repeat1.

Рисунок 3: Кристаллическая структура домена Repeat12.

( a ) Мультяшное изображение домена RyR1 Repeat12 кролика, показывающее α-спирали коричневым цветом и β-нити бежевым.Длинная U-образная структурированная петля («U-крышка»), соединяющая два повтора, обозначена голубым цветом. Позиции для мутаций, связанных с заболеванием, показаны черными палочками и помечены. Трехцепочечный β-лист заполняет пространство между двумя половинами и взаимодействует с первой половиной, частично через солевой мостик между Glu917 и Arg1000. ( b ) Наложение кристаллической структуры домена Repeat12 с моделью, предложенной на основе крио-ЭМ исследований (карта 3,8 Å). В последней модели отсутствует U-крышка и трехниточный β-лист.Кроме того, альфа-спираль в Repeat2 слишком длинна на 14 остатков. ( c ) График сравнения среднеквадратичных значений. значения на остаток для всех ранее предложенных моделей Repeat12 относительно кристаллической структуры. Выделены самые большие различия. ( d ) Выравнивание последовательностей для домена Repeat12 из RyR1, RyR2 и RyR3. Элементы вторичной структуры для структуры RyR1 Repeat12 указаны выше. Мутации, связанные с заболеванием, выделены красным.

Эта структура отличается от предыдущих кристаллических структур домена фосфорилирования (также известного как «Repeats34», кодируемого остатками RyR1 2734-2940) ^12,13 (дополнительные рисунки 3b, 4 и 6).Repeat34 расположен в центре последовательности RyR и образует домен горячей точки фосфорилирования, который демонстрирует высокую псевдосимметрию и видную подковообразную форму. Петли, соединяющие α-спирали, имеют разные конформации, и угол между двумя повторами больше для Repeat34. Важно отметить, что в нем отсутствуют трехцепочечный β-лист и структурированная U-образная крышка. Вместо этого повторы 3 и 4 разделены неструктурированным линкером, который содержит несколько сайтов фосфорилирования в RyR1 и RyR2 (ссылка 12). Эти различия между Repeat12 и Repeat34 изменяют общую поверхность этих двух доменов, в результате чего Repeat12 больше не имеет подковообразную форму (дополнительный рис.4).

U-крышка и трехцепочечный β-лист для домена Repeat12 не были разделены ни в одном из недавних исследований крио-ЭМ интактного RyR1 (ссылки 15, 16, 17). Локальное разрешение различается в разных регионах и оказалось самым низким в угловой области, оцененной в ∼6,2 Å для карты 3,8 Å. Таким образом, домен Repeat12, который, как считается, находится в этом углу, не отслеживался de novo , а был смоделирован на основе структур Repeat34. В результате эти модели существенно отличаются от кристаллической структуры с высоким разрешением, о которой мы сообщаем здесь, с r.m.s.d. значения ∼10 Å для моделируемой части U-крышки и до 20 Å в области β-слоя (рис. 3b, c).

Стыковка в крио-ЭМ картах RyR1

Поскольку недавние крио-ЭМ исследования с высоким разрешением дали противоречивые результаты относительно расположения доменов SPRY, мы решили стыковать эти две новые кристаллические структуры, а также нашу ранее сообщенную структуру SPRY2 ¹¹ в три новые крио-ЭМ карты RyR1 (ссылки 15, 16, 17). Мы использовали беспристрастный шестимерный поиск, реализованный в ADP_EM ³⁵ , который дал идентичные результаты (местоположение и относительная ориентация) на каждой из трех недавних крио-ЭМ-карт (рис.4, дополнительные рисунки 7 и 8). Положение и ориентация домена SPRY2 идентичны предыдущей стыковке, о которой мы сообщили с использованием крио-ЭМ карт с более низким разрешением ¹¹ . Домен SPRY1 расположен рядом с FKBP, а самый популярный домен для Repeat12 находится в углу.

Рис. 4. Расположение SPRY1, Repeat12 и SPRY2 в полноразмерных RyR.

( a ) Общий вид сверху, обращенный к мембране SR со стороны цитозоля, ( b ) Вид сбоку крупным планом и ( c ) Вид сверху нескольких кристаллических структур домена RyR в 3.Крио-ЭМ карта 8-Å кролика RyR1 (EMDB 2807). Разные домены обозначены разными цветами. Положения N-концевых доменов (A, B, C) также показаны для справки. ( d ) Нормализованные коэффициенты корреляции 10 лучших совпадений для стыковки доменов SPRY1, Repeat12 и SPRY2 на карте 3,8 Å. Стыковка двух других недавних карт на 4,8 и 6,1 Å дает идентичные результаты (дополнительные рисунки 7 и 8).

Мы и другие ранее пристыковали домен Repeat34 к углу ^12,13 , теперь занятому доменом Repeat12.Несмотря на улучшенное разрешение карт, прямая стыковка домена Repeat34 по-прежнему дает угловое положение как верхнее попадание с очень похожими коэффициентами корреляции (дополнительный рис. 9). Однако прямое размещение Repeat12 или Repeat34 в месте расположения турели с последующим уточнением твердого тела в Situs ³⁶ дает значительно более высокий коэффициент корреляции для Repeat34 (дополнительный рис. 9). Вместе с назначением фланговых последовательностей области, контактирующей с турелью, домен Repeat34, скорее всего, находится внутри турели, где плотность очень низкая, и несмещенная стыковка впоследствии не выполняется.Это автоматически оставляет только угловое положение для Repeat12, хотя остается видимое несоответствие, потому что плотность крио-ЭМ не поддерживает трехцепочечный β-лист (рис. 4c, дополнительный рис. 9). Это несоответствие, вероятно, из-за внутренней подвижности угловой области, предполагает, что могут потребоваться дальнейшие экспериментальные доказательства или данные крио-ЭМ с более высоким разрешением для однозначного определения позиций Repeat12 и Repeat34.

Визуального осмотра достаточно, чтобы определить, что кристаллическая структура SPRY1 намного лучше, чем SPRY2, рядом с FKBP, функция, поддерживаемая графиками коэффициентов корреляции для каждого вторичного элемента структуры (дополнительный рис.10).

Локализация домена RyR1 SPRY1 на основе FRET

Чтобы проверить нашу стыковку SPRY1, мы провели трилатерацию на основе FRET с использованием набора FKBP, помеченных AlexaFluor488 (AF488, донор), которые могут передавать энергию в зависимости от расстояния. Cy3NTA (акцептор), направленный на декагистидиновые (His ₁₀ ) «метки», вставленные в домен SPRY1. На основе нашей атомной структуры RyR2 SPRY1 мы вставили His ₁₀ -меток в две отдельные открытые поверхности петли в эквивалентных положениях 655 и 675 в кроличьем RyR1 (RyR конструирует His ⁶⁵⁵ и His ⁶⁷⁵ ).Полноразмерные конструкции RyR1, содержащие каждую вставку метки His ₁₀ , экспрессируемую в клетках HEK-293T, не проявляли значительного изменения в индуцированном кофеином высвобождении кальция по сравнению с RyR1 дикого типа (WT) (дополнительная фигура 11).

Мы нацелили каждого из пяти доноров AF488-FKBP на эти His10-меченные RyR (выраженные в клетках HEK) и измерили FRET к акцептору Cy3NTA, присоединенному к метке His ₁₀ . Связывание FKBP с His ⁶⁷⁵ было снижено до менее чем 10% по сравнению с WT RyR1, предполагая, что этот сайт играет важную роль в связывании FKBP / RyR.Следовательно, FRET не может быть измерен для этой конструкции. Однако устойчивый FRET из всех пяти позиций донора FKBP (самый высокий от D32 и самый низкий от D49) наблюдался для Cy3NTA, нацеленного на His ⁶⁵⁵ (рис. 5), что позволяет нам легко определить дискретный локус для Cy3NTA, связанного с His. ⁶⁵⁵ . Этот локус перекрывает петлю 655 в пристыкованном домене SPRY1, но находится> 40 Å от петли 655, предсказанной из альтернативно предложенного положения для SPRY1 (ссылки 15, 16; рис.5; дополнительный рис.12). Этот результат независимо подтверждает наше стыковочное решение для SPRY1 в прямом контакте с FKBP.

Рисунок 5: Трилатерация домена RyR1 SPRY1.

( a ) эффективности FRET от каждого из пяти доноров AF488, ковалентно связанных в указанных положениях FKBP, с 3 мкМ Cy3NTA, нацеленной на клетки HEK-293T, экспрессирующие WT RyR1 (черные полосы), или RyR1, содержащий His ₁₀ -вставка тега в позиции 655 в SPRY1 (His ⁶⁵⁵ , зеленый). Значения представляют собой среднее ± с.Эм. для n = 27–36 клеток, как показано на дополнительном рисунке 13. ( b , c ) Трилатерационный локус His ⁶⁵⁵ (красные сферы) показан относительно атомных структур, пристыкованных к крио-ЭМ карте RyR1 ( EMDB 2807), если смотреть сверху (то есть со стороны мембраны t-канальца in vivo ). Локус трилатерации изображен только относительно одной из четырех субъединиц RyR1 для ясности. Сайты вставки His ₁₀ -тегов в пристыкованный домен SPRY1, а также местоположения пяти AF488-FKBP доноров FRET, используемых для трилатераций (зеленые сферы), показаны в c .Указаны положения для петли 655 и 675 в SPRY1. Также показано расположение SPRY1 из двух недавних исследований крио-ЭМ (синяя цепь, SPRY1alt) и соответствующее положение петель 655 и 675 (модель взята из Zalk и др. , ¹⁶ ). Масштабные линейки, 50 Å (панель b ) и 10 Å (панель c ).

Два недавних исследования крио-ЭМ ^15,16 приписали SPRY2 плотность, следующую за FKBP, а одно — SPRY1 (см.17). Таким образом, наша стыковка и трилатерация подтверждают последнее исследование, но подробный анализ интерфейса SPRY1 – FKBP на основе одного только этого крио-ЭМ исследования невозможен из-за ошибок в регистре последовательности, которые влияют на одну из петель на интерфейсе. С другой стороны, весьма вероятно, что некоторые петли на границах раздела домен-домен принимают конформации, отличные от тех, которые наблюдаются в нашей кристаллической структуре. Поэтому мы решили использовать нашу стыкованную кристаллическую структуру SPRY1 в качестве отправной точки для экспериментов по молекулярной динамике с гибкой подгонкой (MDFF).

Гибкая подгонка молекулярной динамики

MDFF ограничивает вычисления МД в контексте крио-ЭМ карты. Соседние SPRY2 и FKBP были включены для ограничения конформационной свободы SPRY1 и для оптимизации интерфейса SPRY1 – FKBP. Общий коэффициент корреляции карты улучшился по сравнению с ранее предложенной моделью ¹⁷ (рис. 6). Важно отметить, что петли в интерфейсе FKBP показывают улучшенное соответствие между моделью и картой.

Рис. 6. Гибкая подгонка молекулярной динамики домена SPRY1.

( a ) Детализация интерфейса SPRY1 – FKBP12, полученная с помощью MDFF на карте EMD-2807 (3,8 Å). Домен SPRY1 показан голубым цветом, а FKBP12 — бежевым. Меченые остатки соответствуют остаткам, которые находятся в контакте с VDW на интерфейсе, как анализируется с помощью программного обеспечения Chimera ⁵² . Граница раздела закапывает 336 Å ² . ( b ) Подобно тому, как в A, для результата MDFF на карте EMD-6107 (4,8 Å). Граница раздела закапывает 391 Å ² . F674 задействован в обоих случаях.( c ) Коэффициенты взаимной корреляции на элемент вторичной структуры, рассчитанные с помощью VMD ⁵⁶ , для предложенной модели SPRY1 из крио-ЭМ исследования 3,8 Å (черный) и результата MDFF, полученного на той же карте (красный). Результаты различаются в зависимости от региона, но MDFF улучшил общий коэффициент корреляции. Выбранные остатки на интерфейсе указаны для справки, а также области, в которых были внесены существенные улучшения.

Мы проанализировали эти результаты MDFF на картах 3,8 и 4,8 Å в контексте интерфейса SPRY1 – FKBP.В обоих случаях результаты указывают на интерфейс, скрывающий ∼350 Å ² , в первую очередь из-за 6-7 остатков SPRY1 в трех разных петлях (Fig. 6, Supplementary Table 1). Все три петли показывают улучшенные локальные соответствия на карте (рис. 6c). Одна петля, содержащая L719, расположена в области, содержащей двойной сдвиг в регистре последовательности, и поэтому ранее не обнаруживалась в контакте VDW в модели крио-ЭМ 3,8 Å (дополнительная таблица 1). Вторая петля включает остатки H736 и L737, но наибольший контакт с FKBP, по-видимому, происходит с петлей 675, при этом боковая цепь F674 помещается в карман, образованный двумя аргининами на поверхности FKBP.Один из них, R40, теперь идеально подходит для взаимодействия катиона-pi с боковой цепью F674. Соответствие на карте 4.8 Å также предполагает возможное участие L675 в прямом взаимодействии как с F674, так и с FKBP. Хотя точные взаимодействия еще предстоит наблюдать с помощью исследования интерфейса SPRY1 – FKBP с более высоким разрешением, мы решили экспериментально подтвердить результат с помощью анализов связывания FKBP – RyR1.

Анализы связывания FKBP – RyR1

Для количественной оценки эффектов вставки His ₁₀ -меток в домен SPRY1 (полноразмерного RyR1) на связывание FKBP мы создали N-концевые слияния GFP каждой из этих конструкций RyR1 а затем определяли аффинность связывания FKBP ( K _d ) и отклоняющуюся кинетику ( k _от ) с использованием меченного AlexaFluor568 FKBP (AF568 – FKBP).AF568-FKBP связывается аналогично GFP-WTRyR1 и GFP-His ⁶⁵⁵ , тогда как заметно сниженное связывание наблюдается с GFP-His ⁶⁷⁵ (дополнительный рис. 14). Вставка His ⁶⁷⁵ резко увеличила FKBP-RyR1 K _d (уменьшила аффинность связывания), тогда как для связывания FKBP с GFP-His ⁶⁵⁵ ни K _d , ни B _max были значительно изменены по сравнению с GFP-RyR1 (рис. 7a). Изменения аффинности связывания FKBP для GFP-His ⁶⁷⁵ , скорее всего, были вызваны более быстрым k _от , наблюдаемым в экспериментах по диссоциации (рис.7б). Частичное перемешивание только пяти аминокислотных остатков в петле RyR1 SPRY1 675 имело аналогичные эффекты на K _d (рис. 7c) и k _с (рис. 7d), как на вставку His ₁₀ . в положении 675. Поскольку эксперименты с MDFF предполагают решающее участие либо одиночного Phe, либо Phe-Leu кластера в петле 675, мы мутировали оба остатка на Ala в полноразмерном RyR1. Эта двойная замена Ala полностью воспроизводила эффекты вставки His ⁶⁷⁵ или скремблирования петли SPRY1 675 на K _d и k _на (рис.7c, d), что позволяет предположить, что эти гидрофобные остатки играют решающую роль в связывании FKBP-RyR1.

Фигура 7. Анализ связывания FKBP с конструкциями полноразмерного домена RyR1 SPRY1.

( a ) Зависимость от концентрации связывания AF568-FKBP (обозначенного F-FKBP) с указанными слитыми с GFP мутантами RyR1, экспрессируемыми в клетках HEK-293T, относительно слитого с GFP WT RyR1 (черные символы). ( b ) Динамика диссоциации F-FKBP AF568 после отмывки от клеток HEK-293T, экспрессирующих указанные слитые конструкции GFP-RyR1.Кривые представляют соответствие данных с одноэкспоненциальным спадом. ( c , d ) Концентрационная зависимость кривых связывания и диссоциации F-FKBP AF568 для GFP-слитого RyR1 WT и мутантных конструкций, содержащих указанную скремблированную последовательность или двойную замену аланина в петле SPRY1 675. Для всех панелей значения представляют собой среднее ± s.e.m. для n = 16–41 клетка, как показано на дополнительном рис. 14.

Эти результаты полностью согласуются с предполагаемым расположением домена SPRY1.Петля, содержащая остаток 675, расположена непосредственно на границе с FKBP и, таким образом, объясняет резкое влияние вставки His ₁₀ или скремблирования петли на связывание FKBP. Вставка His ₁₀ в сайте 655 пространственно расположена рядом с границей раздела между SPRY1 и Repeat12 (рис. 4, 5c), но оказывается доступной в полноразмерном RyR1, что объясняет, почему вставка не влияет на сродство FKBP. Таким образом, эти результаты согласуются с предложенным нами новым местоположением домена SPRY1 и предполагают, что домен SPRY1 является важным сайтом взаимодействия для FKBP.

Несколько элементов последовательности RyR были ранее предложены в качестве детерминант связывания FKBP, включая предполагаемый сайт фосфорилирования PKA (S2843) и консервативный дипептид VP в положении 2461 (ссылки 21, 31). Мы повторно оценили связывание FKBP с RyR1, содержащим мутации в этих ранее предложенных сайтах. Фосфомиметик S2843D или мутации нулевого фосфорилирования S2843A не оказали значительного влияния на связывание FKBP в нашем анализе (дополнительный рис. 15). Вторая мутация, V2461G, не повлияла на K _d , но существенно повлияла на B _max (дополнительный рис.15). Однако, согласно новым крио-ЭМ картам ^15,16,17 , и S2843, и V2461 расположены далеко (> 60 Å) от FKBP (дополнительный рис. 15b), что позволяет предположить, что на связывание FKBP аллостерически влияет точка — мутация в положении 2,461. Этот аллостерический эффект незначителен по сравнению с мутациями в 675-петле SPRY1.

Мутации, вызывающие заболевания

Кристаллические структуры SPRY1 и Repeat12 позволяют нам подробно изучить окружение аминокислот, связанных с генетическими нарушениями (рис. 8 и 9).Домен Repeat12 может похвастаться позициями для пяти мутаций злокачественной гипертермии в RyR1 и двух мутаций CPVT в RyR2. Некоторые из них находятся на поверхности (рис. 3а), поэтому маловероятно, что они вызовут неправильную складку. Однако мутация RyR1 R1043C ³⁷ (R1044C у кролика RyR1) затрагивает остаток, который участвует во множественных водородных связях, включая атомы основной цепи из U-крышки (рис. 8b). Нарушение взаимодействия может повлиять на конформацию и стабильность U-крышки. Для дальнейшего исследования мы приготовили очищенный мутантный домен Repeat12 и сравнили термостабильность с доменом WT (рис.8c). В то время как WT показывает единственный переход при 41,1 ° C, мутант R1044C показывает два перехода со значениями T _m при 33,6 и 39,6 ° C, что указывает на дестабилизацию субдомена. Мутация G1049S ³⁸ (G1050S у кролика RyR1) расположена в плотной петле около конца Repeat12. Конформация основной цепи находится в области графика Рамачандрана, которая допустима только для остатков глицина. Термический анализ расплава не указывает на дестабилизацию ( T _м 43.1 ° C), но выход очищенного рекомбинантного белка значительно ниже (примерно в 40 раз по сравнению с WT), что позволяет предположить, что значительная часть неправильно свернута во время рекомбинантной экспрессии. RyRs, как было показано, образуют двумерные шахматные решетки в своей естественной среде ^39,40 , а эксперименты по двумерной кристаллизации предполагают, что угловая область участвует в кристаллических контактах ⁴¹ . Таким образом, мутации на поверхности Repeat12 могут мешать контактам между RyR.

Рисунок 8: Связанные с заболеванием мутации в доменах SPRY1 и Repeat12.

( a ) Деталь вокруг RyR2 D720, соответствующая мутации RyR1 D708N, связанной с болезнью мульти-миноядер. D720 расположен внутри «пальца» (красный) и образует солевой мостик с R694. Оба остатка консервативны в RyR1-3. ( b ) Подробная информация о кроличьем RyR1 R1044, который соответствует мутации злокачественной гипертермии человека R1043C. R1044 является частью сети водородных связей, которая включает основную цепь U-образной крышки. ( c ) Температуры плавления для доменов SPRY1 и Repeat12 WT вместе с отобранными мутантами по заболеванию.Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам с n = 4 для каждой. Примечание: кривая плавления R1044C показывает два перехода, что приводит к двум различным температурам плавления.

Рис. 9. Мутация, связанная с заболеванием N760D, влияет на фолдинг и связывание FKBP.

( a ) Подробная информация о RyR2 SPRY1 N771, который соответствует RyR1 N760D кролика или RyR1 N759D человека, связанному с заболеванием центрального ядра. Электронная плотность показана вокруг остатков вблизи N771, который участвует в сети водородных связей (пунктирные линии).Относительное положение FKBP12 (бежевый) согласно стыковке SPRY1 показано для справки. ( b ) Концентрационная зависимость связывания AF568-FKBP (F-FKBP) с GFP-слитой конструкцией N760D RyR1 (соответствует мутанту N759D человека; красные символы) относительно WT RyR1 (черные символы). ( c ) Динамика диссоциации F-FKBP AF568 после отмывки от клеток HEK-293T, экспрессирующих указанные конструкции слияния GFP-RyR1. Кривые представляют соответствие данных с одноэкспоненциальным спадом.Значения представляют собой среднее значение ± s.e.m. для n = 16-60 клеток, как показано на дополнительном рисунке 14. ( d ) Хроматограмма кролика RyR1 SPRY1 WT и мутант N760D, показывающая результаты первой аффинной колонки Ni ²⁺ (как слияние HMT , смотрите методы). Последний пик соответствует элюированию, которое в этом примере в восемь раз ниже. На вставке показан соответствующий SDS – PAGE фракции элюирования.

В SPRY1 три мутации ранее были связаны с заболеванием (рис.2а). Мутация RyR1 человека D708N была связана с болезнью множественных миноядер и атипичным периодическим параличом ⁴² . Соответствующий остаток в RyR2, Asp720, образует солевой мостик с R694 (рис. 8a), который также консервативен среди изоформ RyR. Asp720 расположен на пальце, который выступает из ядра SPRY1 и опосредует взаимодействия с доменом SPRY2. Анализ плавления показывает лишь небольшую дестабилизацию термической стабильности. Хотя эффект невелик (на ~ 1 ° C ниже), домен WT уже имеет низкое значение T _m изолированно (~ 40 ° C, что соответствует ~ 30% разворачивания при 37 ° C), поэтому небольшие изменения могут ударопрочность при физиологических температурах.Мы предполагаем, что первичный эффект мутации находится на взаимодействии SPRY1 – SPRY2.

N760D влияет на связывание FKBP

Учитывая роль домена SPRY1 в связывании FKBP, можно ожидать, что некоторые мутации действуют в первую очередь, влияя на сродство FKBP. Болезненные мутации еще не идентифицированы непосредственно на интерфейсе SPRY1: FKBP, но центральная основная мутация болезни N760D (N759D в RyR1 человека) ⁴³ может косвенно влиять на связывание FKBP. Соответствующий остаток в RyR2 (Asn771) участвует в сети водородных связей, в которую входят Asp753 и His747 (рис.9а), последний из которых непосредственно контактирует с FKBP (рис. 6, дополнительная таблица 1). Эти остатки законсервированы среди всех трех изоформ RyR, предполагая, что сеть также существует в RyR1. Мутация N760D, вероятно, вызовет отталкивание между двумя отрицательно заряженными остатками Asp, что приведет к конформационным изменениям в этой области, близкой к FKBP.

Для дальнейшего изучения этого мы провели исследования связывания FKBP и обнаружили, что N760D вызывает снижение B _max на 74 ± 5%, но не оказывает значительного влияния на аффинность (рис.9b) или k _от (рис. 9c). Учитывая этот удивительный результат, мы более внимательно изучили эту мутацию в изолированном домене RyR1 SPRY1. Множественные испытания экспрессии и очистки этого мутанта неизменно приводили к урожайности, которая была в 4-8 раз ниже по сравнению с WT (фиг. 9d), что свидетельствует о значительном влиянии на сворачивание. Очищенный белок имеет температуру плавления на ~ 3,5 ° C ниже, чем WT (рис. 8c; 36,6 против 40,1 ° C), что не объясняет более низкий выход, поскольку рекомбинантную экспрессию и очистку проводили при 18 ° C и 4 ° C. C соответственно.Эксклюзионная хроматография не показывает признаков агрегации, что позволяет предположить, что очищенный белок сложен. Эти наблюдения согласуются с эффектами на связывание FKBP с пониженным значением B _max из-за ~ 75% неправильно свернутого SPRY1, но неизменным сродством к оставшимся ~ 25%, которое действительно сворачивается должным образом. Мы предполагаем, что остаток N760, таким образом, играет роль в пути сворачивания домена SPRY1. Важно отметить, что эти данные впервые показывают, что мутант по болезни может оказывать сильное влияние на связывание FKBP.

ВАЗ 211440: спецификация

Šiuolaikinė automobilių rinka yra vairikada. Dauguma pagrindinių gamintojai gamina dešimtys modelių, atsižvelgiant labiausiai siauras nišą už labai smulkmeniškas ir reikliausių pirkėjų kovą. Rusijoje, ne mažiau populiarūs buitinė automobiliai, pagal AvtoVAZ sparno. Šiame straipsnyje mes bus kalbėti su jumis apie vieną iš bendrovės modelių — Vazos-211440. Interjero ir eksterjero dizainas, valdomumą, veiklos, tiuningas galimybių — visa tai jūs rasite žemiau.

Pertvarkyti

Модель 2007 г. Baigėsi montavimo linija (serijos originalo 2114 gamyba prasidėjo 2003 m. Balandį), milijonai vairuotojų uždirbo predento neturintį populiarumą. ВАЗ-211440 yra 5 durų hečbekas, taip pat žinomas kitokiu pavadinimu — «Самара-2». Тай ВАЗ-2109 модернизируем (įprasti žmonės — «девыни»). Dauguma pakeitimų palietė kūno priekį, jie labai paveikė automobilio išvaizdą. Modelio išleidimas buvo tendencijos tęsinys, o tai reiškia «šeimos» automotivebilių, kurie puikiai tinka Rusijos keliuose, pardavimas.Pastarasis, kaip žinoma, nesiskiria dėl nepriekaištingos kokybės. Modifikacijos VAZ-211440, kurio nuotrauka yra mūsų straipsnyje, gamyba tęsėsi iki 2013 г., г. Gruodžio mėn.

10 месяцев (базовая версия 2114) Automobilis tapo vienu iš labiausiai parduodamų «АвтоВАЗ» sienų modelių. Automobilis yra geriausias šeimos automotivebilio pasirinkimas žmonėms su ribotu biudžetu. Jos kaina svyruoja nuo 150 и 200 tūkstančių rublių. Beje, modelis iš pradžių buvo vadinamas ВАЗ-2114, дата выпуска 2003 г.Prasidėjo modifikacijos gamyba su patobulinta variklio ir ekologine klase. Mūs herojus yra puikus automotivebilis, derinantis geras technines savybes, komfortą ir dizainą. 2013 г. Jį pakeitė «Лада-Приора», kuri taip pat tapo populiari.

Automobilio išvaizda

Automobilio išorė nusipelno didelės pagirios, nors čia nėra nieko panašaus į prabangos prabangą. Modelis patraukia akis sklandiomis linijomis ir gana pasvirusi optika. Velgiant į autombilš iš skirtingų kampų, galima pastebėti, kad VAZ-211440 dizainas iš esmės skiriasi nuo jo pirmtako su nauju gaubtu, buferiu, žibintais ir radiatoriaus pamušalu.Automobilio dizainas tapo europietiškesnis, представленный кай kuriuos «Renault», «Dacia» и «Opel» modelius. Šis prisitaikymas prie Vakar analogų pritraukė didelį dėmesį Potencialiems pirkėjams, kuriems netrukus patiko ši mašina. Nauji sparnai ir lydiniai tapo dar dviem elementais, kurie buvo pastebimi. Kalbant apie buferį, jis buvo šiek tiek pakeltas lyginant su žeme, todėl automobilis galėjo keliauti ne tik miesto gatvėmis, bet ir šalies keliais. Галине куно далис бевейк непасикейте.

Automobilis ВАЗ-211440 tapo daugiaustabili ir manevringa važiavimo metu, o tai prisidėjo prie mažo tūpimo.Stulbinančios aerodinaminės savybės leidžia jums jaustis labiau pasitikintis kelyje, kuris gali ne tik džiaugtis. Inžinieriai užbaigė mašiną su 14 colių ratais ant štampuotų diskų. Matmenys nepasikeitė nuo «devynių laiko», 4,12 метро ilgio, 1,65 pločio ir 1,4 aukščio.

Automobilio salonas

Kaip ir išvaizda, mūsų salonasherojė tapo labiau rafinuota, įspūdinga moderniu dizainu ir ranga. Žinoma, Vakar konkurentai išlieka toli, tačiau Rusijos automobilio kaina yra atitinkama.Nepaisant santykinai pigių medžiagų ir kieto plastiko, malonu būti automobilio viduje. Kai kurios detalės akivaizdžiai malonu. Maksimalioje konfigūracijoje hečbekas pasižymi geru prietaisų skydeliu, borto kompiuteriu, šildomomis sėdynėmis, elektriniais priekinių durų langais, nauja torpedo ir šildymo sistema. Apskritai daug nuveikta. Nepaisant to, kad dažniausiai naudojamos nebrangios medžiagos, geroji ergonomika ir plokščių įklijavimas interjere iš karto suteikia kiekvienos detalės geros kokybės ir sąmoningumo jausmą.

Borto kompiuteris rodo reikiamą minimumąnaudinga informacija. Manoma, kūrėjai galvoja apie triukšmo izoliaciją. Dabar variklio ir aplinkos garsai ne taip aiškiai įsiskverbė į vidų, todėl kelionė tapo patogesnė ir maloni. Žinoma, tai smalsumas vairuotojams, kurie persikėlė iš jaunesnių modelių.

Automobilis yra labai erdvus, čia lengvaapgyvendinti penkis suaugusius. Galinė sėdynių eilė turi galimybę sulenkti, leidžiant žymiai padidinti bagažo tūr. Pastaroji ypač tinka ilgioms kelionėms ar didelių daiktų gabenimui.Galiausiai automobilio durys buvo įrengtos specialiu mechanizmu, kuris leido jiems atverti beveik 90 laipsnių, o tai padėjo nusileisti ir išlipti.

ВАЗ-211440: techninės charakteristikos, degalų sąnaudos ir pavar dėžė

Paskelbdama modelį, niekas nesitikėjo didelioproveržis. Prieš mus yra tipiškas valstybės darbuotojas, turintis 82 arklio jėgos 82 arklio jėgos variklį. Галиос лигис padidėjo nuo jo pirmtako dienų, kai jis buvo 72 arklio jėgos. Iš pradžių automobilis buvo įrengtas su 8 vožtuvų 1,5 litro varikliu, tačiau 2009 m.Inžinieriai pakeitė šią dalį (VAZ modifikacijos 211440-26 ir 211440-24) į efektyvesnę, uždėdami 16 litrų benzino variklį, kurio tūris buvo 1,6 литра. Galia padidėjo iki 89 arklio galių.

Šiame modelyje katalizatoriaus padėtis buvo perkeltalink variklio. «Devyniose» jis buvo po dugnu. Variklis, savo ruožtu, buvo apsirengęs dekoratyviniu dangčiu. Kalbant apie transmisiją, automobilis turi 5-laipsnę «Mechaniką» ir sustiprintą sankabą. Transmisijos atliekamos paprasčiausiai ir be daug pastangų.Tandeminis variklis — visa dėžė nėra bloga. Kuro suvartojimas miesto cikle yra mažesnis nei 7 литров 100 километров. Нажмите на картинку, чтобы узнать больше о машине ВАЗ-211440. Mašina gali išvystyti 185 km / val. Paspaudimas iki 100 km / h pasiekiamas за 11 секунд, o tai yra gera idėja šios klasės.

Валдымас

inoma, dauguma susidomėjusi klausimu: «Koks yra automotivebilis ir kaip jis veikia?» Atsakymas yra gana nuspėjamas — geriau nei visi jo pirmtakai.Automobilis labai kilniai elgiasi keliuose. Dėl aštrių posūkių tai nesukuria, o trajektorija nesikeičia taip dramatiškai ir netinkamai, kaip buvo pastebėta jaunesniuose modeliuose. Pasiekus didelį greitį, autombilis elgiasi nuspėjamai, o lenktynės tampa be didelių sunkumų, nepaisant silpnos techninės sudedamosios dalies.

Ganyklos padoraus dydžio, skylių, visų rūšiųpažeidimai, tramvajų bėgiai — visa tai praeina be пищит, smūgių ir gedimų. Pakaba yra tanki, vidutiniškai standi. Kūnas nesmiauna, o plastikas taip pat nesukelia erzinančių garsų.

Automobilių tuningas

Kalbant apie automotive tuningų, turėtumėte apsvarstytidaugybė subtilumų, kylančių iš tokio įdomaus processso. Кейчиант «ВАЗ-211440» атсаргинэс дэлис, куриос нэра лабай брангиос, турите присиминти апи стандартус, курьос рейкия судеринти су компетентентингаис асменимис. Prieš pradėdami tobulinti savo automotivebilį, turėtumėte susisiekti su kelių policija, pateikdami jiems pareiškimą, kuriame sakoma apie planuojamus automotivebilių dizaino pakeitimus. Tai yra privalomas dalykas, nepaisant to, jūs galite gauti gana didelę baudą.Be to, pareigūnai išdavė leidimą, į kurį įtrauktos registracijos sąlygos ir techninės transporto priemonės techninio saugumo patvirtinimo dokumento išdavimo tvarka. Jei planuojami globaliniai pokyčiai, reikalingas ekspertų vertinimas, taip pat pridedami techniniai dokumentai.

Baigęs techninį darbą, mašinos savininkasturi pateikti kitą pareiškimą, kuriame reikia nurodyti visus padarytus pakeitimus, jų mastą ir kokybę. Tada automobilio savininkas ją siunčia Patikrinimui, po kurio duomenys registruojami registracijos dokumentuose.Кайп матоте, дирбките дауг.

Variklio tuningas

Rimtai svarstydamas tuningo klausimąautomobiliui, kaip «ВАЗ» («Лада») 211440, verta paminėti, kad automobilis puikiai tinka tokiai drąsiam projektui. Profesionalus modernizavimas leis jai vystytis beprotišku greičiu iki 200 км / ч, taip pat suteiks puikią tvarkymo funkciją. Šiame modelyje yra daug rinkinių paketų, pritaikyt skirtingiems poreikiams ir pageidavimams. Jei norite «išspausti» maksimalų iš automotivebilio, tai yra visos galimybės.Atsargines dalis galima įsigyti automotive rinkoje ir specializuotose parduotuvėse. Laimei, yra daug toki funkcijų.

Вена является популярным пакетом yra tobulinimas.variklis, leidžiantis žymiai padidinti pagrindinio variklio galingumą arba net pakeisti sportiniu partneriu. Norint atlikti nedidelį derinimą, pakanka užfiksuoti valdymo bloką ir keisti kelias gamyklines dalis. По paprastų veiksmų, galios bloko veikimas gali padidėti 10-15%. Jei norite tobulinti variklį, reikia pakeisti cilindro galvutę, ištraukti vožtuvus ir įdiegti naują Mechanizmą, kuris paskirsto dujas.

Tikroji ekstremalė yra radikalivariklio galingumo didinimo metodai. Pavyzdžiui, galite įdėti turbina į variklį VAZ-11440 arba pakeisti senąjį alkūninį veleną sportine varikliu su padidintu stūmoklio eiga. Pastaroji suteiks daugiau sukimo momento, padidins energijos vieneto efektyvumą. Ši galimybė yra gana rizikinga, todėl sprendimą reikia spręsti smoningai. Тайп пат йра гамыклиниų вариклио модификации, кури павыздыс йра «ВАЗ-211440» дурис. 11183 su padidintu sukimo momentu.

Atlikdami PPC nustatymą, turite pakeisti pavarąnumeriai Pagrindinė pavara ir skaičius yra parenkami atsižvelgiant į konkrečius variklio tipus, kurie išsamiai aprašomi dirbtuvėvėvėsevėsevėsevėsevėsevės.Savarankiškai užfiksuojantys diferencialai gali žymiai padidinti sukimo momento perdavimą į autombilio ratus, todėl sunkiu greičiu galite rimtai padidinti trauką «ant dugno».

Pakabos atnaujinimas

Pagrindinė VAZ-211440 charakteristika yragera pakaba, leidžianti važiuoti rusiškais keliais be jokių problemų. Nepaisant to, tikslinga bus sunkiau, dėl ko reikia įsigyti kokybiškų amortizatorių. Norint sumažinti kampą, rekomenduojama įdiegti standžius стабилизатор поперечной устойчивости.

Nepamirškite apie ratus, jei planuojate Regiuotisustabdymas.Iš pirmo žvilgsnio atsiranda vaizdo komponentas. «Keturioliktojoje» yra daug įvairių lydinių ratlankių, esančių įvairiuose specializuotuose parduotuvėse ir rinkose.

Išvaizdos gerinimas

Na, kur be išorinio? Galbūt vienas iš populiariausių tuningo elementų, юбкаų pagerinti automobilio išvaizdą, — aerodinaminiai kėbulo rinkiniai. Automobilis tampa daug gražesnis ir įspūdingas, pritraukdamas praeivių ir kitų vairuotojų akis. Bamperiai, bagetai, galinio vaizdo veidrodžiai, spoileriai — Regiuojamo svorio galimybės.Aukštos kokybės dalys yra labai brangu apsvarstyti. Там tikromis aplinkybėmis visų atsarginių dalių kaina gali viršyti pačios mašinos kainą. ВАЗ-211440 2010 г. Leidimas kainuoja apie 150 tūkst. Рубль. Tuo pačiu metu tik priekiniai žibintai gali kainuoti 30-40 tūkst. Рубль. Labiausiai įspūdingas dizainas pasiekiamas sunkiu inžinierių darbe, pertvarkant kūno dalis. Paprastai pastarąją sudaro oro įleidimo ant stogo ir gaubto įdiegimas, montuojamas spoileris ir šoniniai borteliai, dažomos atskiros kūno dalys ir pan.

Interjero tuningas

Paskutinis rūšiavimo būdas yra kabinos modernizavimas. Dauguma entuziastų ant prietais skydelio įrengia LED žibintus, kurie atrodo labai stilingi. Sėdynę galite pakeisti sportine ar patogesne, pagaminta iš kokybiškų medžiagų. Kitas būdas tobulėti yra automobilių pakrovimas naudojant visas rūšis. Akustinė sistema, GPS navigatorius, sumontuotas borto kompiuteris — yra visko vieta. Baigimo tuningas gali būti tamsintas stiklas. Сварбиаузия — не пернаквоти.ВАЗ-211440 interjeras yra gana konservatyvus ir nuobodus, todėl tuningas bus naudingas tik automobiliui.

Baigiamajame darbe

Rusijos automobilių pramonė turi daugpopuliarus visoje buvusioje Sovietų Sąjungoje. Kiekviename mieste ar kaime galite rasti daugybę automotivebilių, kurie atėjo nuo Volgos gamyklos surinkimo linijos. Šiame straipsnyje mes kalbėjome apie vieną iš VAZ-2114 modifikacijų — VAZ-211440, kurios techninės charakteristikos buvo šiek tiek patobulintos, palyginus su baziniu modeliu.Per visą gamyklos история šis autombilis tapo geriausiai parduodamu dėl gero vidinio ir išorinio dizaino bei geros variklio galios, leidžiančio jam pasiekti didelį greitį. Dėl daugybės paketų, юбка tuningui, buvimas tik labiau populiarino autombilį, kuris vis dar yra labai paklausęs rinkoje.

CPVT-ассоциированная мутация сердечного рианодинового рецептора G357S с пониженной пенетрантностью нарушает прекращение высвобождения Ca2 + и снижает экспрессию белка

PLoS One. 2017; 12 (9): e0184177.

, Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, Написание — первоначальный черновик, Написание — просмотр и редактирование, ¹ , Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, Исследование, ¹ , Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, ² , Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, ¹ , Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, ^{1, ¤} , Концептуализация, Курирование данных, Формальный анализ, Написание — исходный проект, ¹ , Концептуализация, Формальный анализ , Получение финансирования, надзор, написание — первоначальный черновик, написание — проверка и редактирование, ² и, концептуализация, формальный анализ, привлечение финансирования, надзор, написание — первоначальный черновик, написание — просмотр и редактирование ^{1, *}

Инцзе Лю

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Jinhong Wei

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Шивон М.Вонг Кинг Юэнь

² Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Британской Колумбии, 2350 Health Sciences Mall, Ванкувер, Канада

Бо Сан

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Иджун Танг

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Ruiwu Wang

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Филип Ван Петегем

² Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Британской Колумбии, 2350 Health Sciences Mall, Ванкувер, Канада

S.Р. Уэйн Чен

¹ Институт сердечно-сосудистой системы Альберты им. Либина, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

Николь Берд, редактор

¹ Институт сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте, факультет физиологии и фармакологии, Университет Калгари, Калгари, Альберта, Канада

² Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Британской Колумбии, 2350 Health Sciences Mall, Ванкувер, Канада

Университет Канберры, АВСТРАЛИЯ

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов

^¤ Текущий адрес : Госпиталь Тайхэ при Медицинском университете Хубэй, Хубэй, П.Р., Китай.

Поступило 24.03.2017; Принято 18 августа 2017 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника. Эта статья процитирована. другими статьями в PMC.

Abstract

Катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (CPVT) — одна из наиболее смертельных наследственных сердечных аритмий, в основном связанных с мутациями сердечного рианодинового рецептора (RyR2) с высокой пенетрантностью болезни.Интересно, что новая мутация RyR2 G357S, обнаруженная в большой семье из более чем 1400 человек, снизила пенетрантность. Молекулярная основа неполной пенетрантности болезни в этом семействе неизвестна. Чтобы получить представление о вариабельном проявлении болезни в этом семействе, мы определили влияние мутации G357S на функцию и экспрессию RyR2. Мы оценили спонтанное высвобождение Ca ²⁺ в клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 дикого типа и мутант G357S во время перегрузки Ca ²⁺ , также известной как высвобождение Ca ²⁺ , индуцированное перегрузкой магазина (SOICR).Мы обнаружили, что мутация G357S снижает процент клеток, экспрессирующих RyR2, которые демонстрируют SOICR. Однако в ячейках, отображающих SOICR, G357S снизил пороговые значения для активации и завершения SOICR. Кроме того, G357S снижает термостабильность N-концевого домена RyR2 и заметно снижает экспрессию белка полноразмерного RyR2. С другой стороны, мутация G357S не изменяла активацию Ca ²⁺ связывания [ ³ H] рианодина или индуцированное Ca ²⁺ высвобождение Ca ²⁺ из внутриклеточных хранилищ в клетках HEK293.Эти данные показывают, что мутация G357S, связанная с CPVT, усиливает аритмогенный SOICR и снижает экспрессию белка RyR2, что может быть связано с неполной пенетрантностью CPVT в этом семействе.

Введение

Катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (CPVT) — это наследственная опасная для жизни сердечная аритмия, характеризующаяся вызванной стрессом и эмоциями двунаправленной или полиморфной желудочковой тахикардией и внезапной смертью. Интересно, что пациенты, предрасположенные к CPVT, обычно имеют нормальное строение сердца и нормальный электрокардиограф (ЭКГ) в состоянии покоя [1].Гены, кодирующие сердечный рианодиновый рецептор (RyR2), сердечный кальсеквестрин (CASQ2), сердечный триадин и кальмодулин, были связаны с CPVT [1–7]. Большинство случаев CPVT связано с мутациями в RyR2 [1]. Основное внимание в исследованиях последнего десятилетия уделяется пониманию того, как мутации в RyR2 вызывают CPVT. Все больше данных указывает на то, что CPVT вызывается отсроченной постдеполяризацией (DAD) и триггерной активностью [1, 8, 9]. ДАД являются результатом повышенной активности обменника Na ⁺ / Ca ²⁺ в ответ на спонтанное диастолическое высвобождение Ca ²⁺ из саркоплазматического ретикулума (SR) [10–12].Следовательно, спонтанное высвобождение SR Ca ²⁺ является хорошо известной причиной CPVT.

Давно признано, что спонтанное высвобождение SR Ca ²⁺ происходит в форме волн Ca ²⁺ в сердечных клетках, когда нагрузка SR Ca ²⁺ превышает пороговый уровень (SR Ca ^{2 +} порог активации), либо порог снижается до уровня ниже нагрузки SR Ca ²⁺ [13–15]. В свете его зависимости от нагрузки SR Ca ²⁺ и порога активации SR Ca ²⁺ , мы назвали это спонтанное высвобождение SR Ca ²⁺ как индуцированное перегрузкой магазина высвобождение Ca ²⁺ (SOICR ) [1, 16, 17].В подтверждение связи между спонтанным высвобождением Са ²⁺ SR и CPVT было обнаружено, что мутации RyR2, связанные с CPVT, усиливают склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ за счет снижения порога активации для SOICR [1, 8, 16– 20]. Некоторые мутации CPVT RyR2 также увеличивают амплитуду спонтанного высвобождения Ca ²⁺ , задерживая завершение SOICR или снижая порог завершения для SOICR [21]. Таким образом, эти исследования подтверждают мнение о том, что пороги активации и завершения для SOICR являются важными детерминантами восприимчивости к CPVT.

CPVT — одна из самых смертельных сердечных аритмий, встречающихся в основном у молодых людей, внезапная смерть часто является первым симптомом пациентов с CPVT. Средний возраст появления симптомов у субъектов с мутациями RyR2 составляет ~ 17 лет. Более того, многие CPVT-связанные мутации RyR2 (~ 20%) имеют de novo происхождение [22]. Из-за высокой летальности мутаций RyR2, связанных с CPVT, большинство семей с мутациями RyR2 CPVT относительно малы и демонстрируют высокую пенетрантность (50–90%) [23–26]. Интересно, что новая мутация RyR2 G357S недавно была обнаружена в большой семье из 10 поколений и 1404 членов [27].Существует 179 мутантных носителей G357S, 36 из которых пострадали от внезапной сердечной смерти. Несмотря на этот летальный исход для ~ 20% G357S-положительных субъектов, многие носители мутанта G357S жили после пятого десятилетия и даже до 70–80 лет [27]. Это поднимает важный и интересный вопрос о том, почему болезненная экспрессия мутации RyR2 G357S очень вариабельна в этом семействе.

Мутация G357S расположена в N-концевой области канала RyR2, который состоит из трех отдельных доменов: домена A (остатки 1-217), домена B (остатки 218-409) и домена C (остатки 410–217). 631).Эта область образует тетрамерное запирающее кольцо, которое совершает большие движения во время открытия канала [28–31]. Интересно, что делеция отдельных доменов обнаружила различные роли в функции RyR2 [32]. Например, считается, что домен B, в котором находится мутация G357S, важен для экспрессии белка RyR2, а также для активации и терминации SOICR [32]. Неожиданно было показано, что мутация G357S мало влияет на склонность к SOICR в клетках HEK293 [27]. Однако после обработки форсколином, который активирует PKA, клетки HEK293, экспрессирующие G357S, действительно проявляли повышенную активность SOICR по сравнению с экспрессирующими WT клетками, обработанными форсколином [27].Эти наблюдения показывают, что в отличие от других N-концевых мутаций RyR2 CPVT, которые проявляют повышенную активность SOICR в отсутствие активации PKA, влияние мутации G357S на SOICR требует PKA-зависимого фосфорилирования. Предполагается, что эта зависимость от симпатической активации эффекта мутации G357S может вносить вклад в снижение пенентрантности (28%) CPVT у мутантных носителей G357S, которые могут испытывать различные уровни симпатической активации [27]. Однако, помимо изменения ответа на активацию PKA, еще предстоит определить, может ли мутация G357S влиять на другие свойства канала RyR2.

Учитывая роль домена B в функции RyR2, в настоящем исследовании мы оценили влияние мутации G357S на свойства SOICR и экспрессию белка RyR2. Мы обнаружили, что хотя мутация G357S мало влияла на склонность к SOICR, что согласуется с тем, о чем сообщалось ранее [27], она значительно снижает порог активации и завершения для SOICR. Кроме того, мутация G357S снижает термостабильность N-концевого домена RyR2 и резко снижает экспрессию полноразмерного белка RyR2.Однако мутация G357S не изменяла цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию связывания [ ³ H] рианодина или цитозольный Ca ²⁺ , регулируемый высвобождением Ca ²⁺ в клетках HEK293. Заметно сниженная экспрессия белка мутанта G357S может способствовать снижению пенетрантности заболевания в этом большом семействе.

Материалы и методы

Конструирование мутации RyR2-G357S

Точечная мутация G357S в мышином RyR2 была получена методом перекрывающегося удлинения с использованием ПЦР [33, 34].Вкратце, фрагмент NheI / AflII с мутацией G357S был получен путем перекрывающейся ПЦР. Фрагмент NheI / AflII удаляли из продукта ПЦР и использовали для замены соответствующего фрагмента WT в полноразмерной кДНК RyR2 в экспрессионной плазмиде pcDNA5. Мутация и последовательность продукта ПЦР были подтверждены секвенированием ДНК.

Создание стабильных индуцибельных клеточных линий HEK293 и клеточных культур

Стабильные индуцибельные клеточные линии HEK293, экспрессирующие RyR2 WT или мутант G357S, получали с использованием набора Flp-In T-REx Core Kit от Invitrogen.Вкратце, клетки Flp-In T-REx-293 котрансфицировали индуцибельным вектором экспрессии pcDNA5 / FRT / TO, содержащим RyR2 WT или мутантную кДНК, и вектор pOG44, кодирующий рекомбиназу Flp в соотношениях 1: 4, с использованием Ca ^{2. +} метод фосфатного осаждения. Трансфицированные клетки промывали PBS (фосфатно-солевой буфер: 137 мМ NaCl, 8 мМ Na ₂ HPO ₄ , 1,5 мМ KH ₂ PO ₄ и 2,7 мМ KCl, pH 7,4) через 24 часа после трансфекции. путем перехода на свежую среду на 24 ч.Затем клетки снова промывали PBS, собирали и высевали на новые чашки. После прикрепления клеток (~ 4 ч) ростовую среду заменяли средой для отбора, содержащей 200 мкг / мл гигромицина (Invitrogen). Среду для отбора меняли каждые 3–4 дня до тех пор, пока не вырастет желаемое количество клеток. Клетки, устойчивые к гигромицину, объединяли, разделяли на аликвоты (1 мл) и хранили при -80 ° C. Эти положительные клетки считаются изогенными, поскольку интеграция кДНК RyR2 опосредуется рекомбиназой Flp в одном сайте FRT.Клетки HEK293 поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением минимум 0,1 мМ заменимых аминокислот среды Игла, 4 мМ L-глутамина, 100 единиц пенициллина / мл. 100 мг стрептомицина / мл, 4,5 г глюкозы / литр и 10% фетальной телячьей сыворотки при 37 ^o ° C и 5% CO ₂ .

Иммуноблоттинг

Клеточные линии HEK293, выращенные в течение 24 часов после индукции 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma), промывали PBS плюс 2,5 мМ ЭДТА и собирали в том же растворе центрифугированием в течение 8 минут при 700 g в IEC Centra- Центрифуга CL2.Затем клетки промывали PBS без EDTA и снова центрифугировали при 700 g в течение 8 мин. Промытые PBS клетки солюбилизировали в буфере для лизиса, содержащем 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Hepes (pH 7,4), 137 мМ NaCl, 1% CHAPS, 0,5% фосфатидилхолина сои, 2,5 мМ DTT и смесь ингибиторов протеаз (1 мМ бензамидин , 2 мкг / мл лейпептина, 2 мкг / мл пепстатина A, 2 мкг / мл апротинина и 0,5 мМ PMSF). Эту смесь инкубировали на льду в течение 1 часа. Лизаты клеток получали путем двукратного центрифугирования при 16000 g в микроцентрифуге при 4 ° C в течение 30 мин для удаления нерастворимых материалов.Мутантные белки RyR2 WT и G357S подвергали SDS / PAGE (6% гель) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны при 100 В в течение 2 ч при 4 ° C в присутствии 0,01% SDS [35, 36]. Нитроцеллюлозные мембраны, содержащие перенесенные белки, блокировали на 45 мин с помощью 1x PBS и 1% блокатора казеина (Bio-Rad). Заблокированную мембрану инкубировали с антителом против RyR (34C) (Thermo Scientific, MA3-925, разведение 1: 1000), а затем инкубировали с вторичными антителами против [мышиного IgG (тяжелого и легкого)], конъюгированных с пероксидазой хрена ( 1: 20,000 разведение).Для определения β-актина заблокированную мембрану инкубировали с антителом против β-актина (1: 5000), а затем инкубировали с тем же вторичным антителом. После трехкратной промывки в течение 5 мин связанные антитела детектировали с помощью набора для усиленной хемилюминесценции от Pierce.

Одноклеточный цитозольный Ca

²⁺ визуализация клеток HEK293

Цитозольный Ca ²⁺ Уровни в стабильных индуцибельных клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или G357S, контролировали с использованием одиночных клеток Ca ²⁺ визуализации и флуоресцентного Ca ²⁺ — индикаторный краситель Fura-2 AM (ацетоксиметиловый эфир Fura-2), как описано ранее [16, 17].Вкратце, клетки, выросшие на покровных стеклах в течение 18–22 ч после индукции тетрациклином 1 мкг / мл, загружали 5 мкМ Fura-2 AM в буфере KRH (Krebs – Ringer – Hepes) (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ. KH ₂ PO ₄ , 6 мМ глюкозы, 1,2 мМ MgCl ₂ и 25 мМ Hepes, pH 7,4) плюс 0,02% плуроник F-127 и 0,1 мг / мл БСА в течение 20 мин при комнатной температуре (23 ° C ). Затем покровные стекла помещали в перфузионную камеру (Warner Instruments) на инвертированном микроскопе (Nikon TE2000-S). Клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие концентрации внеклеточного Ca ²⁺ (0,0.1, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0 и 2,0 мМ). Кофеин (10 мМ) применяли в конце каждого эксперимента для подтверждения экспрессии активных каналов RyR2. Покадровые изображения (0,25 кадра / с) были захвачены и проанализированы с помощью программного обеспечения Compix Simple PCI 6. Интенсивность флуоресценции измеряли в интересующих областях, сосредоточенных на отдельных клетках. Были проанализированы только клетки, реагирующие на кофеин. Фильтры, используемые для визуализации Fura 2, имели λex = 340 ± 26 нм и 387 ± 11 нм, а λem = 510 ± 84 нм с дихроичным зеркалом (410 нМ).

Визуализация одноклеточного Ca

²⁺ в просвете клеток HEK293

Уровни Ca ^{в просвете 2+} в клетках HEK293, экспрессирующих RyR2-WT или G357S, измеряли с помощью визуализации одноклеточного Ca ²⁺ и FRET (флуоресценция). резонансный перенос энергии) на основе ER luminal Ca ²⁺ -чувствительный белок камелеона D1ER, как описано ранее [19, 37]. Клетки выращивали до 95% конфлюэнтности в колбе ² 75 см, пассировали с PBS и высевали в чашки для культур тканей диаметром 100 мм при ~ 40% конфлюэнтности за 18-20 ч перед трансфекцией кДНК D1ER с использованием осаждения фосфатом кальция. метод.После трансфекции в течение 24 ч питательную среду заменяли на индукционную среду, содержащую 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma). После индукции в течение ~ 22 часов клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим различные концентрации Ca ²⁺ (0, 1 и 2 мМ) и тетракаин (1 мМ) для оценки емкости накопления или кофеина (20 мМ) для оценка минимального уровня запасов путем исчерпания запасов ER Ca ²⁺ при комнатной температуре (23 ° C). В исследованиях проницаемых клеток клетки сначала пермеабилизировали с помощью 50 мкг / мл сапонина в неполной внутриклеточной подобной среде (125 мМ KCl, 19 мМ NaCl и 10 мМ HEPES, pH 7.4 с КОН) при комнатной температуре (23 ° C) в течение 3–4 мин [38]. Затем клетки переводили на полную внутриклеточную среду (неполная внутриклеточная среда плюс 2 мМ АТФ, 2 мМ MgCl ₂ , 0,05 мМ EGTA и 100 нМ свободного Ca ²⁺ , pH 7,4 с КОН) в течение 5–6 мин для удаления сапонина. Затем проницаемые клетки перфузировали различными концентрациями Ca ²⁺ (0,1, 0,2, 0,4, 1 и 10 мкМ), затем тетракаином (1 мМ) для оценки емкости накопления и кофеином (20 мМ) для оценки минимальной уровень магазина, истощив ER Ca ²⁺ магазинов.Изображения получали с помощью программного обеспечения Compix Simple PCI 6 каждые 2 секунды с использованием инвертированного микроскопа (Nikon TE2000-S), оснащенного объективом S-Fluor 20 × / 0,75. Фильтры, используемые для визуализации D1ER, были λex = 436 ± 20 нм для CFP и λex = 500 ± 20 нм для YFP, и λem = 465 ± 30 нм для CFP и λem = 535 ± 30 нм для YFP с дихроичным зеркалом (500 нм ). Количество FRET определяли по соотношению светового излучения при 535 и 465 нм.

[

³ H] Связывание рианодина

Клеточные линии HEK293, выращенные в течение 24 часов после индукции 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma), промывали PBS плюс 2.5 мМ ЭДТА и собирали в том же растворе центрифугированием в течение 8 мин при 700 g в центрифуге IEC Centra-CL2. Затем клетки промывали PBS без EDTA и снова центрифугировали при 700 g в течение 8 мин. Промытые PBS клетки солюбилизировали в буфере для лизиса, содержащем 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Hepes (pH 7,4), 137 мМ NaCl, 1% CHAPS, 0,5% фосфатидилхолина сои, 2,5 мМ DTT и смесь ингибиторов протеаз (1 мМ бензамидин , 2 мкг / мл лейпептина, 2 мкг / мл пепстатина A, 2 мкг / мл апротинина и 0,5 мМ PMSF). Эту смесь инкубировали на льду в течение 1 часа.Лизаты клеток получали путем двукратного центрифугирования при 16000 g в микроцентрифуге при 4 ° C в течение 30 мин для удаления нерастворимых материалов. Равновесное связывание [ ³ H] рианодина с клеточными лизатами проводили, как описано ранее [39] с некоторыми модификациями. [ ³ H] Связывание рианодина проводили в общем объеме 300 мкл связывающего раствора, содержащего 30 мкл клеточного лизата, 500 мМ KCl, 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Hepes (pH 7,4), 5 нМ [ ³ H ] рианодин и CaCl ₂ для высвобождения [Ca ²⁺ ] из pCa ​​9.89 к pCa 4 и смесь ингибитора протеазы при 37 ° C в течение 20 мин. Отношение Ca ²⁺ / EGTA рассчитывали с помощью компьютерной программы, описанной Fabiato и Fabiato [40]. Связывающую смесь разбавляли 5 мл ледяного промывочного буфера, содержащего 25 мМ Трис / HCl, pH 8,0 и 250 мМ KCl, и сразу фильтровали через фильтры Whatman GF / B, предварительно пропитанные 1% полиэтиленимином. Фильтры промывали трижды, и радиоактивность, связанную с фильтрами, определяли жидкостным сцинтилляционным счетом.Неспецифическое связывание определяли путем измерения связывания [ ³ H] рианодина в присутствии 50 мкМ немеченого рианодина. Максимальное связывание [ ³ H] рианодина определяли путем измерения связывания в присутствии 100 мкМ свободного Ca ²⁺ , 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ кофеина. Все анализы связывания проводили в двух экземплярах.

Экспрессия и очистка N-концевого мутантного белка RyR2ABC

Мышиный RyR2 (остатки 1–547 = RyR2ABC), несущий мутацию G357S, очищали с использованием процедур, аналогичных описанным ранее для WT RyR2ABC [41].Вкратце, белок был экспрессирован в штамме E. coli Rosetta как слитый белок, содержащий N-концевую His-метку, белок, связывающий мальтозу, и сайт расщепления протеазой вируса травления табака (TEV). После стадий аффинности с использованием никеля и амилозной смолы метку удаляли с помощью рекомбинантной протеазы TEV и дополнительно очищали с использованием никелевой, анионообменной и эксклюзионной хроматографии.

Термический анализ плавления

Реакционные смеси с конечной концентрацией белка 0.3 мг / мл (в 150 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7,4) и 5000-кратное разведение SYPRO® Orange Protein Gel Stain (Life Technologies) были собраны в 48-луночных реакционных планшетах MicroAmp® Fast Optical (Applied Biosystems) и запечатаны с помощью оптических клейкие крышки (Applied Biosystems). Планшет помещали в систему для ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems) и нагревали от 25 ° C до 95 ° C с изменением температуры на 0,5 ° C за цикл. Для каждой конструкции было выполнено три повтора. Полученные данные были нормализованы, усреднены и нанесены на график с помощью GraphPad Prism5.Первые производные были созданы для расчета температур плавления. Статистическая значимость определялась с использованием непарного двустороннего t-критерия с уровнем достоверности 95%.

Статистический анализ

Все приведенные значения являются средними ± SEM, если не указано иное. Для проверки различий между группами мы использовали тест Стьюдента t (двусторонний). Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Влияние CPVT-ассоциированной мутации RyR2 G357S на склонность к высвобождению Ca

²⁺ , индуцированному перегрузкой запасами (SOICR)

Ранее нами было показано, что CPVT-ассоциированные мутации RyR2 усиливают склонность к накоплению Ca ²⁺ вызванное перегрузкой спонтанное высвобождение Ca ²⁺ (SOICR) в клетках HEK293 [1, 16, 17, 19].Чтобы оценить влияние CPVT-ассоциированной мутации RyR2 G357S на SOICR, мы создали стабильные индуцибельные линии клеток HEK293, экспрессирующие RyR2 WT или мутант RyR2 G357S. Клетки HEK293, экспрессирующие мутант WT или G357S, перфузировали увеличивающимися концентрациями внеклеточного Ca ²⁺ (0–2 мМ) для индукции SOICR, как описано ранее [16, 17]. Затем активность SOICR контролировали, используя флуоресцентный краситель Ca ²⁺ Fura-2 AM и визуализацию одиночных клеток Ca ²⁺ . Количество клеток HEK293, которые проявляли спонтанные колебания Ca ²⁺ при каждой внеклеточной концентрации Ca ²⁺ , было определено и нормализовано к общему количеству клеток, которые отреагировали на кофеин (10 мМ), чтобы получить долю колеблющихся клеток для каждой условие.Увеличение доли колеблющихся клеток в ответ на повышенные внеклеточные концентрации Ca ²⁺ отражает склонность к SOICR. Как показано на фиг. 5, клетки HEK293, экспрессирующие WT и G357S, показали сходные доли колеблющихся клеток при низких концентрациях внеклеточного Ca ²⁺ (0–0,3 мМ). Однако мутант G357S, экспрессирующий клетки HEK293, показал пониженные фракции колеблющихся клеток при более высоких концентрациях внеклеточного Ca ²⁺ (0,5–2 мМ) по сравнению с WT-экспрессирующими клетками HEK293.При 2 мМ внеклеточного Ca ²⁺ доля колеблющихся клеток G357S составляет 47,5 ± 2,5%, что значительно ниже, чем у колеблющихся клеток WT (65,3 ± 4,0%). Следовательно, в отличие от большинства CPVT-ассоциированных мутаций RyR2, мутация G357S снижает максимальную долю клеток HEK293, которые демонстрируют SOICR, но, по-видимому, не увеличивает склонность к SOICR в клетках HEK293 при низких концентрациях внеклеточного Ca ²⁺ .

Влияние CPVT-ассоциированной мутации RyR2 G357S на склонность к высвобождению Ca ²⁺ , вызванному перегрузкой магазинов (SOICR).

Стабильные индуцибельные клетки HEK-293, экспрессирующие RyR2 WT (A) или RyR2 G357S (B), загружали 5 мкМ Fura-2 AM в буфере KRH. Затем клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие уровни внеклеточного Ca ²⁺ (0–2 мМ) для индукции SOICR. Соотношения Fura-2 регистрировали с использованием изображений эпифлуоресценции одиночных клеток Ca ²⁺ . C — процент клеток RyR2 WT (898 клеток) и мутантных клеток G357S (846 клеток), которые проявляли колебания Ca ²⁺ при различных концентрациях внеклеточного Ca ²⁺ (n = 7).Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (*, p <0,01 по сравнению с WT; NS, несущественно).

Мутация G357S снижает пороги активации и терминации для SOICR

Для дальнейшего изучения влияния мутации G357S на свойства SOICR в клетках HEK293, которые демонстрируют SOICR, мы наблюдали за эндоплазматическим ретикулумом (ER) Ca ²⁺ динамика с использованием FRET-просветного зонда D1ER, чувствительного к Ca ²⁺ [19, 37]. Как показано на фиг.4, увеличение внеклеточной концентрации Ca ²⁺ от 0 до 2 мМ индуцировало спонтанные колебания ER Ca ²⁺ в RyR2, экспрессирующих клетки HEK293, что показано как отклонения вниз сигнала D1ER.SOICR возникает, когда Ca ²⁺ в просвете ER достигает порогового уровня активации (F _SOICR ), и прекращается, когда Ca ²⁺ в просвете ER снижается до порогового уровня (F _termi ). Пороги активации и завершения были рассчитаны, как описано в, а фракционное высвобождение Ca ²⁺ (порог активации — порог прекращения) представляет собой долю высвобождения Ca ²⁺ во время SOICR. Мутация G357S значительно снизила порог активации (G357S: 90.1 ± 0,4% по сравнению с WT: 93,2 ± 0,3%) (P <0,01) и порог прерывания (G357S: 50,4 ± 1,3% по сравнению с WT: 58,8 ± 0,9%) (P <0,01) (). Мутация G357S также привела к увеличению фракционного высвобождения Ca ²⁺ (G357S: 39,7 ± 1,0% по сравнению с диким животным: 34,4 ± 0,8%) (P <0,01) (). Емкость накопления ER просвета Ca ²⁺ (F _max -F _min ) существенно не различалась между WT и G357S () (P> 0,1). Более того, SOICR не происходил в контрольных клетках HEK293, не экспрессирующих RyR2, и что на SOICR не влиял ингибитор IP3R, ксестоспонгин C [21], что указывает на то, что SOICR опосредуется RyR2.Эти данные показывают, что мутация G357S увеличивает восприимчивость к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ за счет снижения порога активации SOICR и увеличивает амплитуду спонтанного высвобождения Ca ²⁺ за счет увеличения фракционного высвобождения Ca ²⁺ в результате отложенного завершения SOICR.

Мутация G357S снижает пороги активации и завершения для SOICR.

Стабильные индуцибельные клеточные линии HEK293, экспрессирующие RyR2 WT (A) или мутант G357S (B), трансфицировали основанным на FRET ER просветным Ca ²⁺ -чувствительным белком D1ER и индуцировали с использованием тетрациклина перед экспериментом.Клетки перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие уровни внеклеточного Ca ²⁺ (0–2 мМ) для индукции SOICR. Показаны записи FRET из репрезентативных ячеек (всего 72 для WT и 77 для G357S). Чтобы свести к минимуму влияние перекрестных помех YFP / CFP, мы использовали относительные измерения FRET для расчета порога активации (C) и порога завершения (D), используя уравнения, показанные в A. F _SOICR указывает уровень FRET, на котором возникает SOICR. , тогда как F _termi представляет уровень FRET, на котором завершается SOICR.Дробное высвобождение Ca ²⁺ (E) рассчитывали путем вычитания порога прекращения из порога активации. Максимальный сигнал FRET F _max определяется как уровень FRET после лечения тетракаином. Минимальный сигнал FRET F _мин определяется как уровень FRET после обработки кофеином. Емкость магазина (F) была рассчитана путем вычитания _мин. франков из _макс. франков. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 5–6) (*, p <0,01 по сравнению с WT; NS, недостоверно).

Мутация G357S заметно снижает уровень экспрессии RyR2 в клетках HEK293

Поскольку появление SOICR в клетках HEK293 зависит от экспрессии RyR2 [21], снижение доли колеблющихся клеток, наблюдаемое в клетках HEK293, экспрессирующих G357S, может привести к от нарушения экспрессии мутанта G357S. Чтобы проверить эту возможность, мы провели анализ иммуноблоттинга с использованием антитела против RyR для сравнения уровней белка WT и мутанта G357S, экспрессированного в клетках HEK293.Как показано на фиг.4, уровень экспрессии RyR2 в клетках HEK293, экспрессирующих G357S, составляет 33,6 ± 1,8% от уровня экспрессии в клетках, экспрессирующих RyR2 WT (). Поскольку рианодин связывается только с открытой конформацией RyR, связывание [ ³ H] рианодина широко используется для мониторинга активности канала RyR. Поэтому мы также выполнили связывание [ ³ H] рианодина с лизатами мутантных клеток RyR2 WT и G357S для оценки уровней экспрессии функционального WT и мутантного белка G357S. Согласно данным иммуноблоттинга, максимальное связывание [ ³ H] рианодина (в присутствии 100 мкМ Ca ²⁺ , 2.5 мМ АТФ и 2,5 мМ кофеина) к лизату мутантных клеток G357S составляет 42,5 ± 2,7% от лизата клеток WT (). Эти данные демонстрируют, что мутация G357S существенно снижает уровень экспрессии белка RyR2.

Мутация G357S заметно снижает уровень экспрессии RyR2 в клетках HEK293.

Стабильные индуцибельные клетки HEK293, экспрессирующие RyR2 WT или мутант G357S, собирали и лизировали после индукции в течение 24 часов. Такое же количество белка лизата клеток HEK293 использовали для вестерн-блоттинга (WB) (A, B) с использованием антитела против RyR (34c) и антитела против β-актина или для связывания [ ³ H] рианодина в присутствии 500 мМ KCl, 5 нМ [ ³ H] рианодин, 100 мкМ Ca ²⁺ , 2.5 мМ АТФ и 2,5 мМ кофеина (C). Уровень экспрессии и максимальное связывание [ ³ H] рианодина у мутанта G357S были нормализованы к таковому для RyR2 WT. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 3) (*, p <0,05 по сравнению с WT).

Мутация G357S не влияет на цитозольный Ca

²⁺ -зависимую активацию связывания [ ³ H] рианодина

Наши предыдущие исследования показали, что в зависимости от их местоположения некоторые CPVT-ассоциированные мутации RyR2 усиливают Ca ²⁺ -зависимая активация связывания [ ³ H] рианодина, в то время как другие CPVT-ассоциированные мутации RyR2 нет [16, 17].Чтобы оценить, изменяет ли мутация G357S зависимость Ca ²⁺ от связывания [ ³ H] рианодина, мы выполнили связывание [ ³ H] рианодина с WT и мутантом G357S в присутствии широкого диапазона Ca ^{. 2+} концентраций. Как показано на фиг.3, цитозольная зависимость от Ca ²⁺ связывания [ ³ H] рианодина с мутантом WT и G357S неразличима со значением EC50 0,21 ± 0,01 мкМ для WT и 0,20 ± 0,01 мкМ для G357S (P> 0.1) (). В соответствии с показанными на фиг.1, максимальное связывание [ ³ H] рианодина с мутантом G357S было значительно снижено по сравнению с максимальным связыванием [ ³ H] рианодина с RyR2-WT ().Эти данные предполагают, что мутация G357S не влияет на цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию RyR2.

Мутация G357S не влияет на цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию связывания [ ³ H] рианодина.

[ ³ H] связывание рианодина с клеточными лизатами, полученными из клеток HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или мутант G357S, проводили при различных концентрациях Ca ²⁺ (~ 0,2 нМ-0,1 мМ), 500 мМ KCl и 5 нМ [ ³ H] рианодин.(A) [ ³ H] рианодин, связанный с RyR2 WT или G357S при различных концентрациях Ca ^2+, нормализовали до его собственного максимального связывания (100%). (B) [ ³ H] рианодин, связанный при различных концентрациях Ca ^2+, нормализовали до максимального связывания с RyR2 WT (100%). Показанные точки данных представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех отдельных экспериментов.

Мутация G357S мало влияет на цитозольный Ca

²⁺ -регулируемое высвобождение Ca ²⁺ в клетках HEK293

Чтобы оценить влияние мутации G357S на Ca ²⁺ -зависимую активацию RyR2 в клетке окружающей среде, мы определили уровень высвобождения Ca ²⁺ в проницаемых клетках HEK293, запускаемый различными концентрациями Ca ²⁺ в цитозоле.Клетки HEK293, экспрессирующие мутант RyR2 WT и G357S, сначала были пермеабилизированы, чтобы обеспечить доступ к цитозольному Ca ²⁺ . Затем пермеабилизированные клетки перфузировали различными концентрациями цитозольного Ca ²⁺ (0,1–10 мкМ). Фракционное высвобождение Ca ²⁺ , индуцированное различными цитозольными концентрациями Ca ²⁺ , отслеживали путем измерения стационарного уровня ER Ca ²⁺ , как описано ранее [19, 37, 38]. Как показано на фиг.4, повышение цитозольных концентраций Ca ²⁺ от 0.От 1 до 10 мкМ снижается стабильный уровень ER Ca ²⁺ в пермеабилизированных клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT (), что отражает индуцированное цитозольным Ca ²⁺ фракционное высвобождение Ca ²⁺ из ER Ca ²⁺ store . Устойчивый уровень ER Ca ²⁺ при каждой цитозольной концентрации Ca ²⁺ в клетках HEK293, экспрессирующих мутант G357S, неотличим от уровня в WT-экспрессирующих клетках. Таким образом, в соответствии с данными о связывании рианодина [ ³ H], мутация G357S не влияет на цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию RyR2.

Мутация G357S мало влияет на цитозольное высвобождение Ca ²⁺ , регулируемое высвобождением Ca ²⁺ .

Стабильные индуцибельные линии клеток HEK293, экспрессирующие RyR2 WT (A) или G357S (B), трансфицировали основанным на FRET ER просветным Ca ²⁺ -чувствительным белком D1ER и индуцировали с использованием тетрациклина. Трансфицированные и индуцированные клетки были пермеабилизированы сапонином, промыты и перфузированы внутриклеточной средой плюс увеличивающиеся уровни свободного Ca ²⁺ (0,1, 0.2, 0,4, 1 и 10 мкМ). Показаны записи FRET из репрезентативных ячеек (всего 89 для WT и 87 для G357S). Чтобы свести к минимуму влияние перекрестных помех YFP / CFP, мы использовали относительные измерения FRET для расчета устойчивого уровня ER Ca ²⁺ (определено в A) (C). Пунктирные линии (F _0,1 -F ₁₀ ) указывают на установившиеся уровни FRET после перфузии каждой концентрацией Ca ²⁺ (0,1, 0,2, 0,4, 1 или 10 мкМ). Максимальный сигнал FRET F _max определяется как уровень FRET после лечения тетракаином.Минимальный сигнал FRET F _мин определяется как уровень FRET после обработки кофеином. Емкость магазина (D) была рассчитана путем вычитания _мин. франков из _макс. франков. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 4–6).

Мутация G357S снижает стабильность N-концевой области RyR2

Поскольку мутация G357S снижает экспрессию белка RyR2 (), мы задались вопросом, присущ ли этот эффект N-концевой области, в которой расположена мутация. Мы экспрессировали N-концевую область RyR2 (RyR2ABC), содержащую мутацию G357S, в виде слитого белка с His-меткой и мальтозосвязывающим белком (MBP), удалили метки и очистили его до гомогенности ().показывает кривые термического плавления с использованием Thermofluor. Есть два перехода в термическом расплаве мутанта G357S, причем первый переход имеет температуру плавления значительно ниже, чем у RyR2ABC-WT (RyR2ABC-G357S: 39,8 ± 0,17 ° C по сравнению с RyR2ABC-WT: 42,8 ± 0,17 ° C, P = 0,0002). Эти результаты показывают, что мутация G357S внутренне дестабилизирует действие на RyR2ABC. В контексте полноразмерного RyR2 мутация G357S близка к интерфейсу с центральным доменом, который охватывает горячую точку болезни 3 [1, 42, 43] ().Внутри отдельных доменов RyR2ABC G357 экспонируется на поверхности, и введение сериновой боковой цепи не вызывает каких-либо стерических конфликтов с другой боковой цепью (). Это может показаться противоречащим резко сниженной экспрессии белка RyR2, но более внимательное изучение двугранных углов остова объясняет это. Из-за отсутствия атома С-бета остатки глицина могут принимать конформации, которые не допускаются для других аминокислот. показывает график Рамачандрана для белка RyR2ABC WT (код PDB 4L4H).Остаток G357 расположен в середине запрещенной для неглициновых остатков области. Замена серином, таким образом, вызовет внутреннюю дестабилизацию белка, и мы предполагаем, что это лежит в основе эффекта на стабильность мутантного белка G357S.

Мутация G357S снижает стабильность доменов ABC RyR2.

A. Кристаллическая структура RyR2ABC мыши (остатки 1–547), показывающая три домена и центральный хлорид-анион, который связывает эти три домена вместе. В . Подробности показаны G357S. Конформация остова разрешена для глицина, но не для серина. C. Кривые термического плавления, показывающие термическую стабильность WT RyR2ABC по сравнению с G357S RyR2ABC. Температуры плавления, полученные путем взятия максимумов первых производных, составляют 42,8 ° C ± 0,17 ° C для RyR2ABC WT и 39,8 ° C ± 0,17 ° C для RyR2ABC G357S (ошибки, указывающие на SEM). Статистическая значимость была определена с использованием непарного двустороннего t-критерия с уровнем достоверности 95%, с P = 0.0002. D. График Рамачандрана для кристаллической структуры RyR2ABC с углами фи основной цепи по оси X и углами в фунтах на квадратный дюйм по оси Y. Заштрихованные области указывают предпочтительные области для остатков неглицина. Остатки глицина обозначены квадратами, G357 обозначен стрелкой. E. Крио-ЭМ структура RyR [42, 43], показывающая расположение соответствующего глицина. Один блок, находящийся «спереди» зрителя, был опущен для ясности. Указаны N-концевой участок, центральные домены и пучок внутренней спирали S6 с COOH-концевым доменом (CTD).Эквивалент G357 в RyR1 находится рядом с границей раздела между N-концевой областью и центральным доменом.

Обсуждение

Катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (CPVT) считается одной из наиболее летальных форм наследственной ионной каннелопатии [22, 26, 44–47]. Однако не все пациенты с CPVT испытывают этот высоколетальный фенотип. Недавно Wangüemert et al. [27] описали большую семью из более чем 1400 членов с множественными случаями CPVT и внезапной сердечной смерти.Удивительно, но многие носители мутанта G357S доживали до 50 лет, а некоторые даже до 70–80 лет. Механизм, лежащий в основе этой вариабельной фенотипической экспрессии, неизвестен.

Понимание молекулярных и клеточных дефектов мутации RyR2 G357S может дать некоторые ключи к разгадке снижения пенетрантности CPVT в этом большом семействе. Wangüemert et al. [27] показали, что функциональное воздействие мутации G357S требует активации симпатической нервной системы, и предположили, что эта зависимость от бета-адренергической стимуляции может лежать в основе неполной пенетрантности заболевания в этом семействе.В настоящем исследовании мы определили влияние мутации G357S на функцию и экспрессию RyR2. Мы обнаружили, что N-концевая мутация G357S снижает пороги активации и терминации для аритмогенного спонтанного высвобождения Ca ²⁺ (SOICR), аналогично влиянию других N-концевых мутаций RyR2 CPVT, охарактеризованных ранее [17, 21]. Однако, в отличие от других N-концевых мутаций RyR2 CPVT, мутация G357S также существенно снижает уровень экспрессии белка RyR2.Эти эффекты мутации G357S на пороги SOICR и экспрессию белка, вероятно, вносят вклад в вариабельные фенотипы заболевания, наблюдаемые в этом семействе.

Хорошо известно, что спонтанное высвобождение Ca ²⁺ (SOICR) может приводить к DAD и триггерной активности, что является основной причиной CPVT [1, 8–12]. Следовательно, пониженный порог активации SOICR усилит возникновение SOICR. Кроме того, пониженный порог для завершения SOICR (или отложенного завершения) увеличит дробное высвобождение SR Ca ²⁺ или амплитуду SOICR.Увеличение встречаемости и амплитуды SOICR, в свою очередь, увеличит амплитуду DAD и, следовательно, склонность к триггерной активности и CPVT. Следовательно, повышенная активность SOICR в результате мутации G357S может объяснять летальные фенотипы CPVT, наблюдаемые у некоторых мутантных носителей в этом большом семействе.

Функциональный канал RyR2 состоит из 4 субъединиц, которые образуют тетрамерную структуру. У пациентов, гетерозиготных по мутации G357S, канал RyR2 состоит как из мутанта WT, так и из мутанта G357S.Влияние мутанта на функцию RyR2 будет зависеть от соотношения WT и мутанта, которое зависит от уровня экспрессии WT и мутантных аллелей. В настоящем исследовании мы обнаружили, что мутация G357S существенно снижает уровень экспрессии мутантного белка RyR2. Таким образом, возможно, что вариабельная фенотипическая экспрессия, наблюдаемая в этом большом семействе, может быть связана со сниженной экспрессией мутантного белка G357S. Для проверки этой возможности потребуются будущие исследования с использованием кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), специфичных для пациента.

Ранее мы показали, что мутации CPVT увеличивают склонность к SOICR, о чем свидетельствует увеличение доли клеток, отображающих SOICR. Однако, хотя мутация G357S явно влияет на свойства SOICR (т.е. снижение порога активации и прекращения SOICR и увеличение фракционного высвобождения Ca ²⁺ ), мы не наблюдали увеличения доли клеток, отображающих SOICR. Вероятно, это связано с заметно сниженным уровнем экспрессии мутантного белка.Так как возникновение SOICR в клетках HEK293 зависит от экспрессии RyR2 [21], сниженный уровень экспрессии RyR2 должен уменьшать возникновение SOICR. В соответствии с этой точкой зрения, действительно, мы наблюдали снижение максимальной доли клеток, экспрессирующих G357S, которые проявляли SOICR. Следовательно, повышенная активность SOICR мутанта G357S может быть замаскирована его сниженной экспрессией, когда активности SOICR измеряли с использованием анализа на основе популяций клеток. Однако, когда активности SOICR были измерены в отдельных клетках, которые отображали SOICR, стало ясно, что мутация G357S увеличивает активность SOICR.С другой стороны, мутация G357S не оказывает значительного влияния на цитозольную активацию Ca ²⁺ связывания [ ³ H] рианодина или индуцированное цитозольным Ca ²⁺ фракционное высвобождение Ca ²⁺ в клетках HEK293, что позволяет предположить что мутация G357S мало влияет на цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию RyR2, которая также может вносить вклад в вариабельную экспрессию заболевания в этом семействе.

Механизм, с помощью которого мутация G357S снижает экспрессию белка RyR2, вероятно, присущ N-концевой области RyR2.Мутация находится внутри петли, соединяющей две бета-цепи в домене β-трилистника (домен B). В кристаллической структуре с высоким разрешением N-концевой области RyR2 основная цепь G357 принимает конформацию, которая допустима только для остатка глицина. Таким образом, мутация G357S будет мешать складыванию остова G357. Действительно, мутация G357S также приводит к снижению термостабильности N-концевой области RyR2 (только RyR2ABC). Эквивалентный глицин появляется рядом с границей раздела между N-концевым доменом (горячая точка мутации болезни 1) и центральным доменом, охватывающим горячую точку мутации болезни 3 RyR2 [1, 42, 43].Важно отметить, что недавно было предложено, чтобы центральный домен действовал как преобразователь, интегрирующий конформационные изменения в цитоплазматической сборке в поровый домен канала RyR2, который контролирует закрытие канала [42, 43, 48]. Следовательно, интерфейс между N-концевым и центральным доменами может потребоваться для нормальной аллостерической связи между N-концевым участком и порой канала. Таким образом, мутация G357S может мешать сцеплению, что объясняет ее влияние на SOICR.

Клетки HEK293 широко используются для изучения влияния связанных с заболеванием мутаций RyR на внутренние свойства RyR-канала.Эти исследования позволили получить важную информацию о механизмах заболевания, вызванных рядом мутаций RyR. Однако в клетках HEK293 отсутствуют многие специфические для мышц белки. Т.о., проявляются ли внутренние дефекты CPVT-связанной мутации G357S в экспрессии белков SOICR и RyR2 в сердечных клетках, еще предстоит определить. Для решения этого важного вопроса потребуются будущие исследования с использованием кардиомиоцитов, полученных на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), или моделей мышей, несущих мутацию RyR2 G357S.

Таким образом, в настоящем исследовании мы демонстрируем, что CPVT-ассоциированная мутация RyR2 G357S увеличивает активность SOICR за счет снижения пороговых значений для активации и прекращения SOICR и увеличения фракционного высвобождения Ca ²⁺ . Мутация G357S также заметно снижает экспрессию белка RyR2. Влияние мутации G357S как на активность SOICR, так и на экспрессию белка RyR2 может способствовать снижению пенетрантности CPVT в этом большом семействе.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Канадских институтов исследований в области здравоохранения, Канадского фонда сердца и инсульта, Канадского фонда инноваций и кафедры сердечно-сосудистых исследований Фонда сердца и инсульта (С.R.W.C.). Инцзе Лю является лауреатом студенческой премии Alberta Innovates-Health Solutions (AIHS). Цзиньхонг Вэй является лауреатом премии Института сердечно-сосудистых заболеваний им. Либина в Альберте и стипендии для получения докторской степени от Медицинской школы Камминга. Бо Сун является лауреатом премии Канадского фонда сердца и инсульта для молодых стипендиатов и стипендии AIHS. S.R. Уэйн Чен — ученый AIHS.

Аббревиатуры

CPVT	катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия
RyR2	сердечный рианодиновый рецептор
SR					эндоплазматический эндоплазматический ретикулит вызванное перегрузкой магазина высвобождение Ca 2+
DAD	с задержкой после деполяризации
PBS	фосфатно-солевой буфер.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Канадского института исследований в области здравоохранения, Канадского фонда сердца и инсульта, Канадского фонда инноваций и кафедры сердечно-сосудистых исследований Фонда сердца и инсульта (для SRWC). YL является лауреатом студенческой премии Alberta Innovates-Health Solutions (AIHS). Дж. У. является лауреатом премии Института сердечно-сосудистой системы им. Либина в Альберте и стипендии Медицинской школы Камминга.BS является лауреатом премии Канадского фонда сердца и инсульта для молодых стипендиатов и стипендии AIHS. SRWC — ученый AIHS. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступность данных

Все соответствующие данные приведены в документе

Ссылки

2. Приори С. Г., Наполитано К., Тисо Н., Мемми М., Виньяти Г., Блуиз Р. и другие. (2001) Мутации в гене сердечного рианодинового рецептора (hRyR2) лежат в основе катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии.Тираж. 103, 196–200. [PubMed] [Google Scholar] 3. Лайтинен П. Дж., Браун К. М., Пийппо К., Свон Х., Девани Дж. М., Брамбхатт Б. и другие. (2001) Мутации гена сердечного рианодинового рецептора (RyR2) при семейной полиморфной желудочковой тахикардии. Тираж. 103, 485–490 [PubMed] [Google Scholar] 4. Лахат Х., Прас Э., Олендер Т., Авидан Н., Бен-Ашер Э., Ман О. и другие. (2001) Миссенс-мутация в высококонсервативной области CASQ2 связана с аутосомно-рецессивной катехоламиновой полиморфной желудочковой тахикардией в семьях бедуинов из Израиля.Am J Hum Genet. 69, 1378–1184. DOI: 10.1086 / 324565 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Постма А. В., Данжой И., Хорнтье Т. М., Лупоглазов Дж. М., Да Коста А., Себийон П. и другие. (2002) Отсутствие кальсеквестрина 2 вызывает тяжелые формы катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии. Circ Res. 91, 21e – 26 [PubMed] [Google Scholar] 6. Roux-Buisson N., Cacheux M., Fourest-Lieuvin A., Fauconnier J., Brocard J., Denjoy I. и другие. (2012) Отсутствие триадина, белка комплекса высвобождения кальция, вызывает сердечную аритмию с внезапной смертью у человека.Молекулярная генетика человека. 21, 2759–2767 DOI: 10.1093 / hmg / dds104 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Найгаард М., Овергаард М. Т., Сондергаард М. Т., Вранас М., Бер Э. Р., Хильдебрандт Л. Л. и другие. (2012) Мутации в кальмодулине вызывают желудочковую тахикардию и внезапную сердечную смерть. Американский журнал генетики человека. 91, 703–712 DOI: 10.1016 / j.ajhg.2012.08.015 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Лю Н., Коломби Б., Мемми М., Зиссимопулос С., Рицци Н., Негри С. и другие. (2006) Аритмогенез в катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии: выводы из модели RyR2 R4496C на мышах.Circ Res. 99, 292–298 DOI: 10.1161 / 01.RES.0000235869.50747.e1 [PubMed] [Google Scholar] 9. Паавола Дж., Виитасало М., Лайтинен-Форсблом П. Дж., Пастернак М., Свон Х., Тикканен И. и другие. (2007) Мутантные рецепторы рианодина в катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии генерируют отсроченную постдеполяризацию из-за повышенной склонности к волнам Ca2 +. Европейский сердечный журнал. 28, 1135–1142 DOI: 10.1093 / eurheartj / ehl543 [PubMed] [Google Scholar] 10. Lakatta E.G. (1992) Функциональные последствия спонтанного высвобождения Ca2 + саркоплазматической сети в сердце.Cardiovasc Res. 26, 193–214. [PubMed] [Google Scholar] 12. Орчард К., Эйснер Д. и Аллен Д. (1983) Колебания внутриклеточного Ca 2+ в сердечной мышце млекопитающих. Природа. 304, 735–738 [PubMed] [Google Scholar] 13. Bassani J. W., Yuan W. и Bers D. M. (1995) Фракционное высвобождение SR Ca регулируется триггером содержания Ca и SR Ca в сердечных миоцитах. Am J Physiol. 268, C1313–1319. [PubMed] [Google Scholar] 14. Диаз М. Э., Траффорд А. В., О’Нил С. С. и Эйснер Д. А. (1997) Измерение содержания Са2 + в саркоплазматическом ретикулуме и потоков Са2 + сарколеммы в изолированных миоцитах желудочков крыс во время спонтанного высвобождения Са2 +.Журнал физиологии. 501 (Pt 1), 3–16 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Цзян Д., Сяо Б., Ян Д., Ван Р., Чой П., Чжан Л. и другие. (2004) Мутации RyR2, связанные с желудочковой тахикардией и внезапной смертью, снижают порог выброса Ca2 +, вызванного перегрузкой магазинов (SOICR). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101, 13062–13067 DOI: 10.1073 / pnas.0402388101 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Цзян Д., Ван Р., Сяо Б., Конг Х., Хант Д. Дж., Чой П. и другие. (2005) Повышенное высвобождение Ca2 +, вызванное перегрузкой магазина, и чувствительность каналов к активации Ca2 + в просвете — частые дефекты мутаций RyR2, связанные с желудочковой тахикардией и внезапной смертью.Circ Res. 97, 1173–1181 DOI: 10.1161 / 01.RES.0000192146.85173.4b [PubMed] [Google Scholar] 18. Каннанкерил П. Дж., Митчелл Б. М., Гунасекера С. А., Челу М. Г., Чжан В., Суд С. и другие. (2006) У мышей с мутацией сердечного рианодинового рецептора R176Q наблюдается желудочковая тахикардия и кардиомиопатия, индуцированная катехоламинами. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 103, 12179–12184 DOI: 10.1073 / pnas.0600268103 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19. Джонс П.П., Цзян Д., Болстад Дж., Хант Д. Дж., Чжан Л., Деморекс Н. и другие. (2008) Измерения Ca2 + в эндоплазматическом ретикулуме показывают, что мутации сердечного рианодинового рецептора, связанные с сердечной аритмией и внезапной смертью, изменяют порог выброса Ca2 +, вызванного перегрузкой магазинов. Биохимический журнал. 412, 171–178 DOI: 10.1042 / BJ20071287 [PubMed] [Google Scholar] 20. Седей С., Хайнцель Ф. Р., Вальтер С., Дыбкова Н., Вакула П., Гроборз Дж. и другие. (2010) Na + -зависимая перегрузка SR Ca2 + вызывает аритмогенные события в кардиомиоцитах мыши с мутацией CPVT человека.Сердечно-сосудистые исследования [PubMed] [Google Scholar] 22. Медейрос-Доминго А., Бхуйян З. А., Тестер Д. Дж., Хофман Н., Биккер Х., ван Тинтелен Дж. П. и другие. (2009) RYR2-кодируемый рецептор рианодина / канал высвобождения кальция у пациентов с ранее диагностированной катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией или генотип-отрицательным синдромом удлиненного интервала QT, вызванным физической нагрузкой: комплексный мутационный анализ открытой рамки считывания. Журнал Американского колледжа кардиологии. 54, 2065–2074. DOI: 10.1016 / j.jacc.2009.08.022 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23. Баусе Б., Рампаццо А., Бассо К., Багаттин А., Далиенто Л., Тисо Н. и другие. (2002) Скрининг мутаций рианодинового рецептора типа 2 в семьях с полиморфными желудочковыми аритмиями, вызванными усилием, и внезапной смертью: ранняя диагностика бессимптомных носителей. Журнал Американского колледжа кардиологии. 40, 341–349 [PubMed] [Google Scholar] 24. Хаугаа К. Х., Лерен И. С., Берге К. Э., Батен Дж., Лоеннечен Дж. П., Анфинсен О.ГРАММ. и другие. (2010) Высокая распространенность аритмий, вызванных физической нагрузкой, у членов семьи с положительной мутацией по катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии, диагностированной с помощью каскадного генетического скрининга. Europace: Европейская кардиостимуляция, аритмии и электрофизиология сердца: журнал рабочих групп Европейского общества кардиологов по кардиостимуляции, аритмиям и клеточной электрофизиологии сердца. 12, 417–423 [PubMed] [Google Scholar] 25. Хаяси М., Денджой И., Экстрамиана Ф., Мальтрет А., Бюиссон Н.Р., Лупоглазов Дж. М. и другие. (2009) Частота и факторы риска аритмических событий при катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии. Тираж. 119, 2426–2434 DOI: 10.1161 / CIRCULATIONAHA.108.829267 [PubMed] [Google Scholar] 26. ван дер Верф К., Недеренд И., Хофман Н., ван Геловен Н., Эбинк К., Фрон-Малдер И. М. и другие. (2012) Семейная оценка катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии: пенетрантность и экспрессия болезни у родственников, несущих мутацию рецептора сердечного рианодина.Кровообращение. Аритмия и электрофизиология. 5, 748–756 DOI: 10.1161 / CIRCEP.112.970517 [PubMed] [Google Scholar] 27. Вангумерт Ф., Бош Калеро К., Перес К., Кампусано О., Бельтран-Альварес П., Скорник Ф. С. и другие. (2015) Клиническая и молекулярная характеристика мутации основателя сердечного рианодинового рецептора, вызывающей катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию. Сердечный ритм: официальный журнал Общества сердечного ритма. 12, 1636–1643 [PubMed] [Google Scholar] 28. Амадор Ф. Дж., Лю С., Исияма Н., Плевин М. Дж., Уилсон А., МакЛеннан Д. Х. и другие. (2009) Кристаллическая структура амино-концевого домена бета-трилистника рианодинового рецептора типа I выявляет петлю «горячей точки», связанную с мутациями. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 106, 11040–11044 DOI: 10.1073 / pnas.0

6106 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29. Лобо П. А. и Ван Петегем Ф. (2009) Кристаллические структуры N-концевых доменов рианодиновых рецепторов сердечных и скелетных мышц: понимание мутаций при заболеваниях.Структура (Лондон, Англия: 1993). 17, 1505–1514 [PubMed] [Google Scholar] 30. Тунг С., Лобо П. А., Кимлика Л. и Ван Петегем Ф. (2010) Горячая точка амино-терминального заболевания рианодиновых рецепторов образует цитоплазматический вестибюль. Природа. 468, 585–588 DOI: 10.1038 / nature09471 [PubMed] [Google Scholar] 32. Лю Ю., Сунь Б., Сяо З., Ван Р., Го В., Чжан Дж. З. и другие. (2015) Роль Nh3-концевых доменов сердечного рианодинового рецептора в активации и прекращении высвобождения Са2 +. Журнал биологической химии.290, 7736–7746 DOI: 10.1074 / jbc.M114.618827 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Хо С. Н., Хант Х. Д., Хортон Р. М., Пуллен Дж. К. и Пиз Л. Р. (1989) Сайт-направленный мутагенез путем перекрывающегося удлинения с использованием полимеразной цепной реакции [см. Комментарии]. Ген. 77, 51–59 [PubMed] [Google Scholar] 34. Чжао М., Ли П., Ли Х., Чжан Л., Винкфейн Р. Дж. И Чен С. Р. (1999) Молекулярная идентификация порообразующего сегмента рианодинового рецептора. J Biol Chem. 274, 25971–25974 [PubMed] [Google Scholar] 35.Лэммли У.К. (1970) Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага Т4. Природа. 227, 680–665. [PubMed] [Google Scholar] 36. Towbin H., Staehelin T. и Gordon J. (1979) Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения. Proc Natl Acad Sci U S. A. 76, 4350–4434. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Palmer A. E., Jin C., Reed J. C. и Tsien R. Y. (2004) Bcl-2-опосредованные изменения в Ca 2+ эндоплазматического ретикулума анализировали с помощью улучшенного генетически кодируемого флуоресцентного сенсора.Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 101, 17404–17409 DOI: 10.1073 / pnas.0408030101 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Тиан X., Лю Ю., Лю Ю., Ван Р., Вагенкнехт Т., Лю З. и другие. (2013) Лиганд-зависимые конформационные изменения в области зажима сердечного рианодинового рецептора. Журнал биологической химии. 288, 4066–4075 DOI: 10.1074 / jbc.M112.427864 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Ли П. и Чен С. Р. (2001) Молекулярная основа ca (2) + активация сердечного ca (2) мыши + канал высвобождения (рецептор рианодина).J Gen Physiol. 118, 33–44. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 40. Фабиато А. и Фабиато Ф. (1979) Калькуляторные программы для расчета состава растворов, содержащих несколько металлов и лигандов, используемых для экспериментов с кожными мышечными клетками. J Physiol (Париж). 75, 463–505 [PubMed] [Google Scholar] 41. Kimlicka L., Tung C. C., Carlsson A. C., Lobo P. A., Yuchi Z. и Van Petegem F. (2013) N-концевая область сердечного рианодинового рецептора содержит сайт связывания аниона, на который нацелены мутации при болезни.Структура (Лондон, Англия: 1993). 21, 1440–1449 [PubMed] [Google Scholar] 43. Пэн В., Шен Х., Ву Дж., Го В., Пан X., Ван Р. и другие. (2016) Структурные основы стробирующего механизма рианодинового рецептора 2 типа RyR2. Наука (Нью-Йорк, Нью-Йорк) [PubMed] [Google Scholar] 44. Приори С. Г., Наполитано К., Мемми М., Коломби Б., Драго Ф., Гаспарини М. и другие. (2002) Клиническая и молекулярная характеристика пациентов с катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией. Тираж. 106, 69–74.[PubMed] [Google Scholar] 45. Тестер Д. Дж., Спун Д. Б., Вальдивия Х., Макельски Дж. С. и Акерман М. Дж. (2004) Целевой мутационный анализ рецептора сердечного рианодина, кодируемого RyR2, при внезапной необъяснимой смерти: молекулярное вскрытие 49 случаев судмедэкспертизы / коронера. Труды клиники Мэйо. 79, 1380–1384 DOI: 10.4065 / 79.11.1380 [PubMed] [Google Scholar] 46. Наполитано С. и Приори С. Г. (2007) Диагностика и лечение катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии.Сердечный ритм: официальный журнал Общества сердечного ритма. 4, 675–678 [PubMed] [Google Scholar] 47. Ростон Т. М., Винокур Дж. М., Мажино К. Р., Мохаммед С., Салерно Дж. К., Этеридж С. П. и другие. (2015) Катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия у детей: анализ терапевтических стратегий и результатов международного многоцентрового регистра. Кровообращение. Аритмия и электрофизиология. 8, 633–642 DOI: 10.1161 / CIRCEP.114.002217 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Мутация h39D не усиливает цитозольную активацию Ca2 + сердечного рецептора рианодина

Abstract

N-концевой домен сердечного рианодинового рецептора (RyR2) несет в себе большое количество естественных мутаций, которые связаны со стресс-индуцированной желудочковой тахиаритмией и внезапной смертью.Почти все эти связанные с заболеванием N-концевые мутации расположены на границах домена или скрыты внутри доменов. Мутации в этих местах будут изменять взаимодействия домен-домен или стабильность / сворачивание доменов. Недавно было обнаружено, что новая мутация RyR2 h39D, связанная с желудочковой аритмией в состоянии покоя, усиливает активацию отдельных каналов RyR2 за счет диастолических уровней цитозольного Ca ²⁺ . В отличие от других N-концевых мутаций, связанных с заболеванием, мутация h39D расположена на поверхности N-концевого домена.Неясно, как эта открытая на поверхности мутация h39D, которая, по-видимому, не взаимодействует с другими частями структуры RyR2, может изменять внутренние свойства канала. Здесь мы провели подробную функциональную характеристику мутанта RyR2-h39D на молекулярном и клеточном уровнях. Мы обнаружили, что мутация h39D не влияет на базальный уровень или зависимую от Ca ²⁺ активацию связывания [ ³ H] рианодина с RyR2, цитозольную активацию Ca ²⁺ отдельных каналов RyR2 или цитозольную активацию. Ca ²⁺ — или вызванное кофеином высвобождение Ca ²⁺ в клетках HEK293.Кроме того, мутация h39D не изменяет склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ или пороговые значения для активации или прекращения высвобождения Ca ²⁺ . Более того, мутация h39D не оказывает значительного влияния на термостабильность N-концевой области (остатки 1–547) RyR2. В совокупности наши данные показывают, что мутация h39D оказывает незначительное влияние или совсем не влияет на функцию RyR2 или на стабильность укладки N-концевой области. Таким образом, наши результаты не предоставляют доказательств того, что мутация h39D усиливает цитозольную активацию Ca ²⁺ RyR2.

Образец цитирования: Xiao Z, Guo W, Yuen SMWK, Wang R, Zhang L, Van Petegem F, et al. (2015) Мутация h39D не усиливает активацию цитозольного Ca ²⁺ сердечного рецептора рианодина. PLoS ONE 10 (9): e0139058. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058

Редактор: Николь Берд, Университет Канберры, АВСТРАЛИЯ

Поступила: 30 июня 2015 г .; Принята к печати: 7 сентября 2015 г .; Опубликован: 25 сентября 2015 г.

Авторские права: © 2015 Xiao et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах бумага.

Финансирование: Эта работа была поддержана исследовательскими грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения, Фонда сердца и инсульта Альберты, Канадского фонда инноваций и Фонда сердца и инсульта / Института сердечно-сосудистых заболеваний им. Либина, профессора в области сердечно-сосудистых исследований. С.R.W.C., научный сотрудник Alberta Innovates-Health Solutions (AIHS). FVP поддерживается CIHR (125893).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: RyR2, сердечные рецепторы рианодина; CPVT, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия; SR, саркоплазматический ретикулум; ER, эндоплазматическая сеть; PBS, забуференный фосфатом физиологический раствор; SOICR, вызванная перегрузкой магазина Ca ²⁺ релиз

Введение

Рецептор сердечного рианодина (RyR2) является важным компонентом взаимодействия возбуждения и сокращения в сердце [1,2].RyR2 также играет важную роль в патогенезе сердечных аритмий и кардиомиопатий. [2–5]. На сегодняшний день идентифицировано более 150 естественных, связанных с заболеванием мутаций в RyR2. Однако функциональные последствия большинства этих связанных с заболеванием мутаций RyR2 полностью неизвестны. Функционально охарактеризована лишь небольшая часть этих мутаций RyR2. Для улучшения диагностики и лечения заболеваний, связанных с RyR2, необходимо понимать функциональное влияние мутаций RyR2, связанных с заболеванием.

Недавние важные достижения в определении трехмерной (3D) структуры RyR предоставили неоценимые и подробные сведения о молекулярных механизмах связанных с заболеванием мутаций RyR. Например, недавно были решены структуры с высоким разрешением N-концевой области RyR [6–16]. N-концевая область RyR2 состоит из трех доменов: двух доменов, которые образуют β-трилистники (остатки домена A 1-217), домена B (остатки 218-409) и домена C (остатки 410-543), который является частью более длинный α-соленоид в неповрежденных RyR [14–16].Картирование более чем 50 ассоциированных с заболеванием мутаций в трехмерной структуре N-концевых доменов показало, что все ассоциированные с заболеванием мутации в этой области локализуются на границах домена или скрыты внутри отдельных доменов [8,12,13]. В RyR2 эти интерфейсы доменов кажутся особенно важными: центральный ион хлорида координируется остатками всех трех доменов, и нарушение связывания посредством вызывающих болезнь мутаций приводит к переориентации домена [8,12,13]. Эти наблюдения привели к предположению, что вызывающие заболевание мутации в N-концевой области дестабилизируют границы раздела доменов или нарушают сворачивание отдельных доменов, что нарушает взаимодействия домен-домен и структурные изменения, необходимые для правильного стробирования канала [6 , 8,9,11–13,17].В соответствии с этой гипотезой мы показали, что ряд ассоциированных с заболеванием мутаций в N-концевой области изменяют активацию и / или инактивацию канала RyR2 [18–22].

Недавно была идентифицирована новая мутация RyR2, h39D, которая, как полагают, связана с полиморфной желудочковой тахикардией в состоянии покоя с короткой связью [23]. Функциональная характеристика с использованием одноканальных записей в плоских липидных бислоях показала, что одиночные мутантные каналы h39D демонстрируют усиленную цитозольную активацию Ca ²⁺ при диастолических цитозольных концентрациях Ca ²⁺ по сравнению с одиночными RyR2 WT каналами [23].Было высказано предположение, что мутация h39D вызывает «протекающий» канал при низких концентрациях цитозольного Ca ²⁺ , и что «протекающий» RyR2 может быть механизмом полиморфной желудочковой тахикардии в покое [23]. Однако, в отличие от всех других известных мутаций N-терминального заболевания [8,12,13], мутация h39D не находится на границе домена или внутри домена. Мутация h39D расположена в петле между бета-листами 1 и 2 и картирована на поверхности структуры RyR2, которая обращена к поперечной трубчатой ​​мембране [14–16].Более того, было показано, что боковая цепь h39 демонстрирует большую гибкость в множественных кристаллических структурах N-концевой области RyR2 [12], что дополнительно указывает на то, что она не образует значительных взаимодействий с любыми другими остатками. Как же тогда мутация h39D могла повлиять на внутренние свойства канала RyR2? Чтобы ответить на этот вопрос, в настоящем исследовании мы охарактеризовали мутант h39D на молекулярном и клеточном уровнях с помощью ряда функциональных и биохимических анализов. Мы обнаружили, что мутация h39D не изменяет базальный уровень или зависимость Ca ²⁺ связывания [ ³ H] рианодина с RyR2.Одноканальный анализ показал, что мутация h39D не влияла на активацию цитозольного Ca ²⁺ одиночных каналов RyR2. Мутация h39D также не влияла на активацию RyR2 кофеином или склонность к высвобождению Ca ²⁺ , вызванному перегрузкой магазинов (SOICR). Мутация h39D также не изменяла цитозольную зависимость высвобождения Ca ²⁺ от Ca ²⁺ или порог активации или прекращения SOICR. Кроме того, мутация h39D не влияла на экспрессию канала RyR2 или термостабильность N-концевых доменов RyR2.В совокупности наши данные показывают, что мутация h39D существенно не изменяет внутренние свойства RyR2. Наши результаты не подтверждают мнение о том, что мутация h39D вызывает «дырявый» канал RyR2.

Материалы и методы

Конструирование мутации RyR2-h39D

Точечная мутация, h39D, в RyR2 мыши была получена методом перекрывающегося удлинения с использованием ПЦР [24,25]. Вкратце, фрагмент NheI-AflII с мутацией h39D получали с помощью перекрывающейся ПЦР.Фрагмент NheI-AflII удаляли из продукта ПЦР и использовали для замены соответствующего фрагмента дикого типа (WT) в полноразмерной кДНК RyR2 в экспрессионной плазмиде pcDNA5. Мутация и последовательность продукта ПЦР были подтверждены секвенированием ДНК.

Получение стабильных индуцибельных клеточных линий HEK293

Стабильные индуцибельные линии клеток HEK293, экспрессирующие RyR2-WT или мутант RyR2-h39D, были созданы с использованием набора Flp-In T-REx Core Kit от Invitrogen [26]. Вкратце, клетки Flp-In T-REx-293 котрансфицировали индуцибельным вектором экспрессии pcDNA5 / FRT / TO, содержащим кДНК WT или мутантного RyR2, и вектор pOG44, кодирующий рекомбиназу Flp в соотношениях 1: 5, с использованием Ca ^{2. +} метод фосфатного осаждения.Трансфицированные клетки промывали PBS через 24 часа после трансфекции с последующим переходом на свежую среду на 24 часа. Затем клетки снова промывали PBS, собирали и высевали на новые чашки. После прикрепления клеток (~ 4 ч) ростовую среду заменяли средой для отбора, содержащей 200 мкг / мл гигромицина (Invitrogen). Среду для отбора меняли каждые 3–4 дня до тех пор, пока не вырастет желаемое количество клеток. Клетки, устойчивые к гигромицину, объединяли, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.Эти положительные клетки считаются изогенными, поскольку интеграция кДНК RyR2 опосредована рекомбиназой Flp в одном сайте FRT. Обработка и хранение клеточной линии эмбриональной почки человека 293 (HEK293) были одобрены институциональным комитетом по биобезопасности Университета Калгари.

[

³ H] рианодиновое связывание Клетки

HEK293 высевали в чашки для тканевых культур диаметром 100 мм при ~ 10% конфлюэнтности за 18-20 ч перед трансфекцией с помощью кДНК RyR2 WT или мутанта h39D.После трансфекции в течение 24 ч клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса, содержащем 25 мМ Трис, 50 ​​мМ HEPES, pH 7,4, 137 мМ NaCl, 1% CHAPS, 0,5% яичного фосфатидилхолина, 2,5 мМ DTT и смесь ингибиторов протеаз ( 1 мМ бензамидин, 2 мкг / мл лейпептина, 2 мкг / мл пепстатина A, 2 мкг / мл апротинина и 0,5 мМ PMSF) на льду в течение 60 мин. Лизат клеток получали после удаления нерастворимых материалов путем двукратного центрифугирования в микроцентрифуге при 4 ° C в течение 30 мин каждое. Равновесное связывание [ ³ H] рианодина с клеточными лизатами проводили, как описано ранее [27] с некоторыми модификациями.[ ³ H] Связывание рианодина проводили в общем объеме 300 мкл связывающего раствора, содержащего 30 мкл клеточного лизата, 100 мМ KCl, 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Hepes (pH 7,4), 5 нМ [ ³ H ] рианодин и CaCl ₂ , чтобы освободить [Ca ²⁺ ] от pCa 9,89 до pCa 4, и смесь ингибитора протеазы при 37 ° C в течение 20 мин. Отношение Ca ²⁺ / EGTA рассчитывали с использованием компьютерной программы Fabiato и Fabiato [28]. Связывающую смесь разбавляли 5 мл ледяного промывочного буфера, содержащего 25 мМ Трис, pH 8.0 и 250 мМ KCl и сразу же фильтровали через фильтры Whatman GF / B, предварительно пропитанные 1% полиэтиленимином. Фильтры промывали трижды, и радиоактивность, связанную с фильтрами, определяли жидкостным сцинтилляционным счетом. Неспецифическое связывание определяли путем измерения связывания [ ³ H] рианодина в присутствии 50 мкМ немеченого рианодина. Все анализы связывания проводили в двух экземплярах.

Вестерн-блоттинг

клеточных линий HEK293, выращенных в течение 24 ч после индукции, промывали PBS (137 мМ NaCl, 8 мМ Na ₂ HPO4, 1.5 мМ KH ₂ PO ₄ , 2,7 мМ KCl) плюс 2,5 мМ ЭДТА и собирали в том же растворе центрифугированием в течение 8 мин при 700 x g в центрифуге IEC Centra-CL2. Затем клетки промывали PBS без EDTA и снова центрифугировали при 700 x g в течение 8 мин. Промытые PBS клетки солюбилизировали в буфере для лизиса, содержащем 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Hepes (pH 7,4), 137 мМ NaCl, 1% CHAPS, 0,5% фосфатидилхолина сои, 2,5 мМ DTT и смесь ингибиторов протеаз (1 мМ бензамидин, 2 мкг / мл лейпептина, 2 мкг / мл пепстатина A, 2 мкг / мл апротинина, 0.5 мМ PMSF). Эту смесь инкубировали на льду в течение 1 часа. Лизат клеток получали путем двукратного центрифугирования при 16000 x g в микроцентрифуге при 4 ° C в течение 30 минут для удаления несолюбилизированных материалов. Мутантные белки RyR2 WT и h39D подвергали 6% SDS-PAGE [29] и переносили на нитроцеллюлозные мембраны при 45 В на 18–20 ч при 4 ° C в присутствии 0,01% SDS [30]. Нитроцеллюлозные мембраны, содержащие перенесенные белки, блокировали на 30 мин PBS, содержащим 0,5% твин-20 и 5% сухого обезжиренного молока.Заблокированную мембрану инкубировали с антителом против RyR (34c) (1: 1000), а затем инкубировали с вторичными антителами против IgG мыши (H&L), конъюгированными с пероксидазой хрена (1: 20000). После трехкратной промывки в течение 5 мин связанные антитела детектировали с помощью набора для усиленной хемилюминесценции от Pierce.

Очистка рекомбинантных белков RyR2 для одноканального анализа

Рекомбинантные мутантные каналы RyR2 WT и h39D очищали из клеточного лизата клеток HEK293, трансфицированных RyR2 WT или мутантной кДНК h39D, центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, как описано ранее [18,27].Вкратце, RyR2 WT или лизаты мутантных клеток h39D (2,5 мл) наносили слоями поверх 5 мл (7,5-25% мас. / Мас.) Линейного градиента сахарозы, содержащего 25 мМ Трис, 50 ​​мМ HEPES, pH 7,4, 0,3 М NaCl. , 0,1 мМ CaCl ₂ , 0,3 мМ EGTA, 0,25 мМ PMSF, 4 мкг / мл лейпептина, 5 мМ DTT, 0,3% CHAPS и 0,16% синтетического фосфатидилхолина. Градиент центрифугировали при 29000 об / мин в роторе Beckman SW-41 при 4 ° C в течение 17 часов. Собирали фракции по 0,7 мл каждая. Пиковые фракции, содержащие белки RyR, как определено иммуноблоттингом, объединяли, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C.

Одноканальные записи в плоских липидных бислоях

Одноканальные записи выполнялись, как описано ранее [26]. Вкратце, фосфатидилэтаноламин (50%) и фосфатидилсерин головного мозга (50%) (Avanti Polar Lipids), растворенные в хлороформе, объединяли, сушили в атмосфере азота и ресуспендировали в 30 мкл л n -декана при концентрации 12 мг липидов на мл. Бислои были сформированы через отверстие 250 мкм в перегородке из делрина, разделяющей две камеры.Транскамера (800 мкл) была подключена к входу головного каскада усилителя Axopatch 200A (Axon Instruments, Остин, Техас). Цис-камеру (1,2 мл) удерживали на виртуальной земле. Симметричный раствор, содержащий 250 мМ KCl и 25 мМ Hepes (pH 7,4), использовали для всех записей, если не указано иное. Аликвоту 4 мкл (≈ 1 мкг белка) очищенного в градиенте плотности сахарозы рекомбинантного RyR2 WT или мутантных каналов h39D добавляли в цис-камеру. Одиночные каналы были включены в бислои в записывающем растворе без добавления EGTA или Ca ²⁺ .Активность спонтанного канала тестировали на чувствительность к EGTA и Ca ²⁺ путем добавления EGTA (200 мкМ) в камеру цис или транс для определения ориентации встроенного канала. Камера, в которую добавление EGTA ингибировало активность встроенного канала, предположительно соответствует цитозольной стороне канала высвобождения Ca ²⁺ . Затем EGTA-ингибированный канал реактивировали добавлением различных концентраций Ca ²⁺ (50–300 мкМ).Направление одноканальных токов всегда измеряли от просвета к цитозольной стороне канала, если не указано иное. Записи фильтровались с частотой 2500 Гц. Анализ данных проводился с использованием программного пакета pclamp 8.1 (Axon Instruments). Концентрации свободного Ca ²⁺ рассчитывали с помощью компьютерной программы Fabiato и Fabiato [28].

Вызванное кофеином высвобождение Ca

²⁺ в клетках HEK293

Концентрацию свободного цитозольного Ca ²⁺ в трансфицированных клетках HEK293 измеряли с помощью флуоресцентного индикаторного красителя Ca ²⁺ Fluo-3 (Molecular Probes) [26].Клетки HEK293, выращенные на 100-миллиметровых чашках для культивирования тканей в течение 18–20 часов после пересева, трансфицировали 12–16 мкг RyR2 WT или мутантной кДНК h39D. Клетки, выросшие в течение 18-20 часов после трансфекции, промывали четыре раза PBS и инкубировали в KRH (Krebs-Ringer-Hepes. 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ KH ₂ PO ₄ , 6 мМ глюкозы, 1,2 мМ MgCl ₂ , 2 мМ CaCl ₂ и 25 мМ HEPES, pH 7,4) буфер без MgCl ₂ и CaCl ₂ при комнатной температуре в течение 40 минут и при 37 ° C в течение 40 минут.После отделения от чашек для культивирования пипеткой клетки собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 2 мин в роторе Beckman TH-4. Осадки клеток загружали 10 мкМ Fluo-3 AM в среде Игла с высоким содержанием глюкозы, модифицированной Дульбекко, при комнатной температуре в течение 60 мин с последующей промывкой буфером KRH плюс 2 мМ CaCl ₂ и 1,2 мМ MgCl ₂ (KRH + буфер) три раза и ресуспендировали в 150 мкл буфера KRH + плюс 0,1 мг / мл BSA и 250 мкМ сульфинпиразона. Клетки, нагруженные Fluo-3 AM, добавляли к 2 мл (конечный объем) буфера KRH + в кювете.Интенсивность флуоресценции Fluo-3 при 530 нм измеряли до и после повторных добавлений или однократных добавлений различных концентраций кофеина (0,025-5 мМ) в люминесцентном спектрометре SLM-Aminco серии 2 с возбуждением 480 нм при 25 ° C (SLM Instruments) . Пиковые уровни каждого вызванного кофеином высвобождения Ca ²⁺ были определены и нормализованы до наивысшего уровня (100%) вызванного кофеином высвобождения Ca ²⁺ для каждого эксперимента.

Одноклеточный Ca

²⁺ визуализация (измерения цитозольного Ca ²⁺ ) в клетках HEK293

Уровни цитозольного Ca ²⁺ в стабильных индуцибельных клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или мутант h39D, контролировали с помощью визуализации Ca ²⁺ одной клетки и флуоресцентного индикаторного красителя Ca ²⁺ Fura-2, как описано ранее [ 18,26,31].Вкратце, клетки, выросшие на покровных стеклах в течение 8-18 часов после индукции (как указано) 1 мкг / мл тетрациклина (Sigma), загружали 5 мкМ Fura-2, AM в буфере KRH (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 6 мМ глюкоза, 1,2 мМ MgCl ₂ и 25 мМ Hepes, pH 7,4) плюс 0,02% плуроник F-127 и 0,1 мг / мл БСА в течение 20 мин при комнатной температуре (23 ° C). Затем покровные стекла помещали в перфузионную камеру (Warner Instruments) на инвертированном микроскопе (Nikon TE2000-S). Клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие концентрации внеклеточного Ca ²⁺ (0,0.1, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0 и 2,0 мМ). Кофеин (10 мМ) применяли в конце каждого эксперимента для подтверждения экспрессии активных каналов RyR2. Покадровые изображения (0,25 кадра / с) были захвачены и проанализированы с помощью программного обеспечения Compix Simple PCI 6. Интенсивность флуоресценции измеряли в интересующих областях, сосредоточенных на отдельных клетках. Были проанализированы только клетки, реагирующие на кофеин. Фильтры, используемые для визуализации Fura-2, имели λex = 340 ± 26 нм и 387 ± 11 нм, а λem = 510 ± 84 нм с дихроичным зеркалом (410 нМ).

Визуализация одиночных клеток Ca

²⁺ (измерения Ca ^{в просвете 2+} ) в клетках HEK293

Уровни Ca ²⁺ в просвете в клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или мутанты, измеряли с использованием визуализации одноклеточного Ca ²⁺ и FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии) -чувствительного белка ER luminal Ca ²⁺ -чувствительного верблюжьего белка. D1ER, как описано ранее [32,33]. Клетки выращивали до 95% слияния в колбе ² 75 см, пассировали с PBS и высевали в чашки для культур тканей диаметром 100 мм при ~ 10% слияния за 18-20 часов до трансфекции кДНК D1ER с использованием осаждения фосфатом кальция. метод.После трансфекции в течение 24 ч питательную среду заменяли на индукционную среду, содержащую 1 мкг / мл тетрациклина. В исследованиях интактных клеток после индукции в течение ~ 22 часов клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим различные концентрации CaCl ₂ (0, 1 и 2 мМ) и тетракаин (1 мМ) для оценки емкости запаса или кофеина ( 20 мМ) для оценки минимального уровня запаса путем истощения запасов ER Ca ²⁺ при комнатной температуре (23 ° C). В исследованиях проницаемых клеток клетки сначала проницались 50 мкг / мл сапонина [34] в неполной внутриклеточной подобной среде (ICM) при комнатной температуре (23 ° C) (неполная ICM содержит 125 мМ KCl, 19 мМ NaCl, и 10 мМ HEPES, pH 7.4, с КОН) в течение 3–4 мин. Затем клетки переводили на полный ICM (неполный ICM плюс 2 мМ АТФ, 2 мМ MgCl ₂ и 0,05 мМ EGTA и 100 нМ свободный Ca ²⁺ , pH 7,4, с КОН) в течение 5–6 минут для удаления сапонин. Затем проницаемые клетки перфузировали различными концентрациями Ca ²⁺ (0,1, 0,2, 0,4, 1 и 10 мкМ), затем тетракаином (1 мМ) для оценки емкости запаса и кофеином (10 мМ) для оценки минимального запаса. уровень за счет истощения запасов ER Ca ²⁺ .Изображения получали с помощью программного обеспечения Compix Simple PCI 6 каждые 2 с с использованием инвертированного микроскопа (Nikon TE2000-S), оснащенного объективом S-Fluor 20 × / 0,75. Фильтры, используемые для визуализации D1ER, были λex = 436 ± 20 нм для CFP и λex = 500 ± 20 нм для YFP, и λem = 465 ± 30 нм для CFP и λem = 535 ± 30 нм для YFP с дихроичным зеркалом (500 нм ). Количество FRET определяли по соотношению светового излучения при 535 и 465 нм.

Очистка мутантного белка RyR2ABC

кДНК RyR2 мыши (кодирующие остатки 1–547) была экспрессирована в клетках Escherichia coli Rosetta (DE3) pLacI (Novagen) с использованием модифицированного вектора pET28, как описано ранее [12,13].Мутация h39D была введена протоколом QuikChange (Stratagene). Клетки, экспрессирующие мутант h39D, лизировали ультразвуком в буфере A (250 мМ KCl и 10 мМ буфер HEPES, pH 7,4) с добавлением 20 мМ имидазола и 50 мкг / мл ДНКазы I, 50 мкг / мл лизоцима, 7 мМ β-меркаптоэтанола (bME), 1 мМ фенилметилсульфона. фторид и 10% (об. / об.) глицерин. Лизат наносили на 2 колонки HisTrap по 5 мл (GE Healthcare), промывали 15 объемами колонки (CV) буфера A и элюировали 80% (об. / об.) буфером B (250 мМ KCl и 500 мМ имидазола, pH 7.4). Белок диализовали против буфера А плюс 7 мМ bME и одновременно расщепляли рекомбинантной протеазой TEV. Затем белок наносили на колонку с амилозой 25 мл (New England Biolabs), промывали 10 CV буфера A и элюировали буфером C (буфер A плюс 10 мМ мальтоза). Белок наносили на 25 мл колонку Talon (ClonTech) в буфере A, а затем запускали на колонке Q Sepharose High Performance (GE Healthcare) с использованием буфера D (50 мМ KCl, 10 мМ Tris pH 8,0 и 7 мМ bME) и элюировали градиентом от 0% до 20% буфера E (1M KCl, 10 мМ Tris, pH 8.0 и 7 мМ bME). Затем белок наносили на колонку HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare) в буфере E и элюировали градиентом от 100% до 0% буфера D. Наконец, белок запускали на HiLoad 16/60 Superdex 200 колонка для гель-фильтрации подготовительного класса (GE Healthcare) в буфере, состоящем из 250 мМ KCl, 10 мМ HEPES (pH 7,4) и 7 мМ bME. Белок концентрировали до 12 мг / мл с использованием концентраторов Amicon (отсечение молекулярной массы 10 кДа; Millipore) и использовали в свежем виде. Белок RyR2 (1–547) дикого типа очищали аналогичным образом с небольшой разницей: колонка HiLoad Q-Sepharose HP отсутствовала.

Термический анализ расплава

Кривые плавления белков были измерены с помощью термофлуоресцентных экспериментов [35], как описано ранее для других конструкций RyR [7–9,12,13]. Вкратце, образцы для кривых плавления содержали 50 мкл очищенного белка с концентрацией 0,3 мг / мл и 1x раствор SYPRO Orange (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя в буфере, состоящем из 150 мМ KCl, 10 мМ HEPES (pH 7,4) и 14 мМ bME. Расплавы получали в машине для ПЦР в реальном времени opticon 2 ДНК (BIORAD) с использованием опции зеленого фильтра SYBR.Температуру изменяли с 25 ° C до 95 ° C с шагом 0,5 ° C. На каждом этапе температура поддерживалась постоянной в течение 15 с. Температуры плавления были получены путем усреднения точек пиков первых производных кривых плавления из пяти повторных прогонов.

Статистический анализ

Все указанные значения являются средними ± SEM, если не указано иное. Для проверки различий между группами мы использовали критерий Стьюдента t (двусторонний). Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Мутация RyR2-h39D не влияет на базальный уровень или зависимость Ca

²⁺ связывания [ ³ H] рианодина

Поскольку рианодин связывается только с открытым состоянием канала RyR, связывание [ ³ H] рианодина обычно используется в качестве индекса для вероятности открытия (Po) RyR. Кроме того, поскольку [ ³ H] рианодин, как только он связывается с RyR, очень медленно диссоциирует из канала, равновесный анализ связывания [ ³ H] рианодина, выполняемый в течение нескольких часов, очень чувствителен для обнаружения открытий RyR, особенно в условиях Po канала очень низкое.Поэтому мы использовали анализ связывания рианодина [ ³ H] для определения влияния мутации h39D на базальную активность RyR2 при низких концентрациях Ca ²⁺ и зависимую от Ca ²⁺ активацию канала. Как показано на фиг. 1, мутация h39D не оказывала значительного влияния на связывание [ ³ H] рианодина с RyR2 при низких концентрациях Ca ²⁺ (45–150 нМ) (фиг. 1A). Кроме того, не было значительной разницы в EC ₅₀ Ca ²⁺ -зависимой активации связывания [ ³ H] рианодина между RyR2 WT (0.193 ± 0,002 мкМ) и мутант h39D (0,203 ± 0,008 мкМ) (P = 0,338) (рис. 1A). Мы также выполнили связывание [ ³ H] рианодина с лизатом из клеток HEK293, котрансфицированных RyR2 WT и h39D (в соотношении 1: 1), чтобы имитировать гетерозиготную экспрессию мутанта h39D у пациентов (т.е. h39D ^+/- ) . Мы обнаружили, что h39D ^+/- не влияет на EC ₅₀ Ca ²⁺ -зависимой активации связывания [ ³ H] рианодина (0,200 ± 0,002 мкМ) (P = 0,914). Следует отметить, что уровень экспрессии мутантов RyR2 WT и h39D схож (рис. 1B и 1C).Таким образом, наши данные показывают, что мутация h39D не усиливает открытия канала RyR2 при низких концентрациях Ca ²⁺ или чувствительности канала к активации Ca ²⁺ .

Рис. 1. Влияние мутации h39D на зависимую от Ca ²⁺ активацию связывания [ ³ H] рианодина с RyR2.

(A) [ ³ H] Связывание рианодина с клеточным лизатом из клеток HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или мутант h39D, осуществляли при различных концентрациях Ca ²⁺ (~ 0.От 2 нМ до 0,1 мМ), 100 мМ KCl и 5 нМ [ ³ H] рианодина. Количества связывания [ ³ H] рианодина при различных концентрациях Ca ²⁺ нормализовали до максимального связывания (100%). Показанные точки данных представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из 3 отдельных экспериментов. (B, C) Иммуно-блоттинг RyR2 WT и мутанта h39D из одинакового количества клеточных лизатов с использованием антитела против RyR (34c) (n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g001

Мутация h39D не изменяет цитозольную активацию Ca

²⁺ отдельных каналов RyR2

Чтобы напрямую оценить влияние мутации h39D на активацию RyR2 в цитозоле Ca ²⁺ , мы определили ответ отдельного RyR2 WT и мутантных каналов h39D на различные концентрации цитозольного Ca ²⁺ (от 45 нМ до 50 мкМ). с использованием одноканальных записей в плоских липидных бислоях.Как показано на фиг. 2, как одиночные RyR2 WT, так и мутантные каналы h39D демонстрируют сходную вероятность открытия (Po) при низких уровнях цитозольного Ca ²⁺ (фиг. 2A и 2B). Не было значительных различий в Po между одиночными мутантными каналами RyR2 WT и h39D при каждой тестируемой цитозольной концентрации Ca ²⁺ (рис. 2C). Кроме того, также не было значительных различий в поведении гейтирования между одиночными RyR2 WT и мутантными каналами h39D. Среднее время открытия составило 2,67 ± 0,65 мс для WT и 3.87 ± 0,39 мс для h39D ( P = 0,148), а среднее время закрытия составляло 17,91 ± 7,20 мс для WT и 11,06 ± 3,20 для h39D ( P = 0,409). Таким образом, мутация h39D не оказывает значительного влияния на Po или закрытие канала RyR2 при низких концентрациях Ca ²⁺ в цитозоле или ответ канала на активацию цитозольного Ca ²⁺ .

Рис. 2. Влияние мутации h39D на цитозольную активацию Ca ²⁺ одиночных каналов RyR2.

Одноканальные активности RyR2 WT (A) и h39D (B) регистрировали в симметричном записывающем растворе, содержащем 250 мМ KCl и 25 мМ Hepes (pH 7.4). EGTA добавляли в камеру цис или транс для определения ориентации встроенного канала. Сторона канала, к которой добавление EGTA ингибировало активность встроенного канала, предположительно соответствует цитоплазматической поверхности. Концентрация Ca ²⁺ как на цитоплазматической, так и на просветной стороне канала была доведена до ~ 45 нМ. Затем цитозольную концентрацию Ca ²⁺ увеличивали до различных уровней путем добавления аликвот раствора CaCl ₂ .Потенциал записи был -20 мВ. Открытия направлены вниз, и указаны базовые линии (короткие столбцы). Показаны вероятность открытия (Po), среднее время открытия (To) и среднее время закрытия (Tc). Взаимосвязь между Po и цитозольными концентрациями Ca ²⁺ (pCa) отдельных каналов RyR2 WT (темные кружки) и мутантных h39D (белые кружки) каналов показаны на панели C.Показанные точки данных представляют собой среднее значение ± SEM для 7 RyR2 WT и 5 одиночные каналы h39D.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g002

Мутация h39D не влияет на цитозольную регуляцию Ca

²⁺ высвобождения Ca ²⁺ в клетках HEK293

Затем мы оценили влияние мутации h39D на регуляцию RyR2 цитозольным Ca ²⁺ в клеточном контексте. Мы измерили устойчивый уровень ER Ca ²⁺ в пермеабилизированных клетках HEK293 [34], экспрессирующих RyR2 WT или мутант h39D при различных цитозольных концентрациях Ca ²⁺ (0,1–10 мкМ). Как показано на фиг. 3, инкубация пермеабилизированных клеток HEK293, экспрессирующих RyR2 WT, с увеличением цитозольных концентраций Ca ²⁺ (100 нМ -10 мкМ) снижала уровень устойчивого состояния ER Ca ²⁺ (фиг. 3A и 3C).Это снижение стабильного уровня ER Ca ²⁺ , вероятно, отражает индуцированное цитозольным Ca ²⁺ фракционное высвобождение Ca ²⁺ из хранилища ER Ca ²⁺ . В соответствии с отсутствием влияния на активацию Ca ²⁺ связывания [ ³ H] рианодина и отдельных каналов, мутация h39D не оказывала значительного изменения цитозольного Ca ²⁺ , индуцированного фракционным высвобождением Ca ²⁺ в HEK293. клетки (рис. 3С). Таким образом, эти данные показывают, что мутация h39D не изменяет цитозольную Ca ²⁺ -зависимую активацию высвобождения Ca ²⁺ .

Рис. 3. Влияние мутации h39D на цитозольный Ca ²⁺ , индуцированный высвобождением Ca ²⁺ в клетках HEK293.

Стабильные индуцибельные линии клеток HEK293, экспрессирующие RyR2 WT (A) или мутант h39D (B), трансфицировали основанным на FRET ER просветным Ca ²⁺ -чувствительным белком D1ER, и их экспрессию индуцировали с использованием тетрациклина. Трансфицированные и индуцированные клетки были проницаемы сапонином, промыты и перфузированы внутриклеточной средой плюс увеличивающиеся уровни свободного цитозольного Ca ²⁺ (0.1, 0,2, 0,4, 1,0 и 10 мкМ), чтобы вызвать высвобождение Ca ²⁺ . Показаны записи FRET из репрезентативных ячеек (всего 51–93 ячейки в каждой). Чтобы свести к минимуму влияние перекрестных помех CFP / YFP, мы использовали относительные измерения FRET для расчета устойчивого состояния уровня ER Ca ²⁺ (определенного на панели A). Пунктирные линии (F _{0,1 —} F ₁₀ ) указывают на установившиеся уровни FRET после перфузии с каждой концентрацией Ca ²⁺ (0,1, 0,2, 0,4, 1,0 или 10 мкМ). Максимальный сигнал FRET F _max определяется как уровень FRET после применения тетракаина.Минимальный сигнал FRET F _мин определяется как уровень FRET после применения кофеина. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 4–5).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g003

Мутация h39D не влияет на реакцию RyR2 на кофеин

Ранее мы показали, что цитозольный Ca ²⁺ и кофеин вызывают разные конформационные изменения в структуре RyR2, предполагая разные механизмы активации RyR2 этими лигандами [34].Хотя мутация h39D не изменяет активацию RyR2 цитозольным Ca ²⁺ , неясно, влияет ли она на активацию RyR2 кофеином. С этой целью мы оценили ответы клеток HEK293, экспрессирующих RyR2 WT и мутант h39D, на кофеин. Как показано на фиг. 4, применение дополнительных концентраций кофеина (от 0,05 мМ до 0,5 мМ) индуцировало высвобождение Ca ²⁺ в клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT с увеличенной амплитудой. Амплитуда вызванного кофеином высвобождения Ca ²⁺ снижалась при более высоких концентрациях кофеина (1.От 0 мМ до 5 мМ). Это снижение, вероятно, было результатом истощения внутриклеточных запасов Ca ²⁺ из-за предшествующих применений кофеина (от 0,025 до 0,5 мМ) [36] (рис. 4A). Клетки HEK293, экспрессирующие мутант h39D, проявляли кофеиновый ответ, очень похожий на ответ клеток, экспрессирующих RyR2 WT (рис. 4B и 4C). Таким образом, мутация h39D не влияет на активацию RyR2 кофеином.

Рис. 4. Влияние мутации h39D на активацию RyR2 кофеином.

Клетки

HEK293 трансфицировали RyR2 WT (A) или мутантом h39D (B).Интенсивность флуоресценции трансфицированных клеток, нагруженных Fluo-3, до и после добавления кофеина в возрастающих концентрациях (0,025-5 мМ) отслеживали непрерывно. (C) Соотношение между высвобождением Ca ²⁺ и кумулятивной концентрацией кофеина в клетках HEK293, трансфицированных RyR2 WT и мутантом h39D. Амплитуда каждого пика кофеина была нормализована к амплитуде максимального пика для каждого эксперимента. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 5).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g004

Мутация h39D не влияет на склонность к спонтанному высвобождению Ca

²⁺

Общим дефектом мутаций RyR2, связанных с CPVT, является повышенная склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ во время перегрузки запаса Ca ²⁺ , процесс, который мы назвали индуцированным высвобождением Ca ²⁺ с перегрузкой магазина (SOICR) . Чтобы определить, влияет ли мутация h39D на возникновение SOICR, клетки HEK293, экспрессирующие RyR2 WT или мутант h39D, перфузировали повышенными внеклеточными концентрациями Ca ²⁺ (0–2.0 мМ), чтобы вызвать спонтанные колебания Ca ²⁺ (SOICR), как описано ранее [18,26,31]. Полученный SOICR затем исследовали с помощью визуализации одной клетки Ca ²⁺ . Как показано на фиг. 5, RyR2 WT (фиг. 5A) и h39D (фиг. 5B), экспрессирующие клетки HEK293, показали сходное процентное соотношение клеток, которые отображали колебания Ca ²⁺ при каждой внеклеточной концентрации Ca ²⁺ (фиг. 5C). Таким образом, эти результаты показывают, что мутация h39D не влияет на склонность к SOICR.

Рис. 5. Влияние мутации h39D на склонность к SOICR в клетках HEK293.

Стабильные индуцибельные клетки HEK293, экспрессирующие RyR2 WT и мутант h39D, загружали 5 мкМ Fura-2 AM в буфере KRH. Затем клетки непрерывно перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие уровни внеклеточного Ca ²⁺ (0–2 мМ) для индукции SOICR. Соотношения Fura-2 репрезентативных клеток RyR2 WT (A) и h39D (B) регистрировали с использованием эпифлуоресцентной визуализации одиночных клеток Ca ²⁺ .(C) Процент клеток RyR2 WT (всего 1087 клеток) и h39D (всего 1161 клеток), которые демонстрируют колебания Ca ²⁺ при различных внеклеточных концентрациях Ca ²⁺ . Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 9–10).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g005

Мутация h39D не изменяет порог активации или терминации SOICR

Чтобы дополнительно оценить влияние мутации h39D на SOICR, мы определили порог активации и терминации SOICR в клетках HEK293, экспрессирующих RyR2 WT или мутант h39D.Пороги активации и терминации SOICR определялись путем измерения уровней Ca ²⁺ в просвете эндоплазматического ретикулума (ER) с использованием D1ER, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) на основе белка ER просвета Ca ²⁺ [32,33] . Как показано на фиг. 6, клетки HEK293, экспрессирующие RyR2 WT, проявляли спонтанные колебания ER Ca ²⁺ при увеличении внеклеточной концентрации Ca ²⁺ от 0 до 2 мМ. Как сообщалось ранее [20,21,33], SOICR возникал, когда содержание Ca ²⁺ в просвете ER достигал порогового уровня (F _SOICR ), и прекращался, когда содержание Ca ²⁺ в просвете ER снижалось до другого порогового значения. уровень (F _termi ) (рис. 6A).На фиг.6B показан SOICR в клетках HEK293, экспрессирующих мутант h39D. Не было значительной разницы в пороге активации SOICR (h39D: 92,9 ± 0,2% по сравнению с WT: 92,2 ± 0,2%) (рис. 6C) или пороге завершения (h39D: 58,0 ± 0,7% по сравнению с WT: 58,5 ± 1,1%). (Рис 6D). Также не было значительной разницы в фракционном высвобождении Ca ²⁺ (h39D: 35,0 ± 0,9% по сравнению с WT: 33,7 ± 0,9%) (рис. 6E) или емкости накопителя (F _макс. -F _мин. ). между RyR2 WT и мутантом h39D (рис. 6F). Более того, SOICR не встречается в контрольных клетках HEK293 (без RyR2), и что SOICR опосредуется RyR2, поскольку ингибитор IP3R, ксестоспонгин C, не влияет на SOICR [20].Следовательно, эти данные указывают на то, что мутация h39D не влияет на активацию и завершение SOICR.

Рис. 6. Влияние мутации h39D на порог SOICR в клетках HEK293.

Стабильные индуцибельные линии клеток HEK293, экспрессирующие RyR2 WT или h39D, трансфицировали основанным на FRET ER просветным Ca ²⁺ , чувствительным белком D1ER за 48 ч до визуализации FRET отдельных клеток. Экспрессия RyR2 WT и h39D индуцировалась за 24 ч до визуализации. Клетки перфузировали буфером KRH, содержащим возрастающие уровни внеклеточного Ca ²⁺ (0–2 мМ) для индукции SOICR.За этим следовало добавление 1,0 мМ тетракаина для ингибирования SOICR, а затем 20 мМ кофеина для истощения запасов ER Ca ²⁺ . Показаны записи FRET из репрезентативных клеток RyR2 WT (A) и h39D (B) (всего 68 клеток каждая). Порог активации (C) и порог завершения (D) были определены с использованием уравнений, показанных на панели A. F _SOICR указывает уровень FRET, на котором возникает SOICR, а F _termi представляет уровень FRET, на котором заканчивается SOICR.Дробное высвобождение Ca ²⁺ (E) рассчитывали путем вычитания порога прекращения из порога активации. Максимальный сигнал FRET F _max определяется как уровень FRET после лечения тетракаином. Минимальный сигнал FRET F _мин определяется как уровень FRET после обработки кофеином. Емкость магазина (F) была рассчитана путем вычитания _мин. франков из _макс. франков. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0139058.g006

Мутация h39D не влияет на термостабильность N-концевой области RyR2

Расположение остатка h39 на поверхности RyR2, вдали от любого интерфейса с другими доменами RyR2 или известными вспомогательными белками (рис. 7A и 7B), подтверждает отсутствие функциональных эффектов. В предыдущих кристаллических структурах конструкции RyR2 (1–547) боковая цепь h39 демонстрирует большую гибкость, дополнительно указывая на то, что она не образует значительных взаимодействий с соседними остатками.Мутации, вызывающие заболевание, также могут действовать, вызывая общую дестабилизацию белковой складки, которая затем может косвенно приводить к взаимодействиям измененных доменов. В самом деле, было обнаружено, что многие болезнетворные мутации в RyRs значительно дестабилизируют складку, на что указывает пониженная термостабильность [7,12,13,37]. Расположение на поверхности делает этот сценарий для мутации h39D маловероятным, но мы решили подтвердить это, очистив вариант h39D RyR2 (1–547) и подвергнув его термическому анализу плавления.Как показано на фиг. 7C, N-концевая область мутанта h39D демонстрирует температурную зависимость разворачивания белка, аналогичную зависимости N-концевой области WT. Таким образом, эти данные показывают, что мутация h39D не оказывает значительного влияния на стабильность N-концевых доменов канала RyR2.

Рис. 7. Влияние мутации h39D на термостабильность N-концевых доменов RyR2.

Расположение остатка h39 в трехмерной структуре N-концевых доменов RyR2 на виде сверху (A) и виде сбоку (B).Центральный хлорид-ион показан сферой. На панели А также показано относительное расположение N-концевой области RyR2 на недавно полученной крио-ЭМ карте RyR1. (С). Типичные кривые термического плавления N-концевых доменов RyR2 (RyR2ABC) WT (темные кружки) и мутанта h39D (светлые кружки) (n = 5).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139058.g007

Обсуждение

Естественно возникающие мутации в сердечном рианодиновом рецепторе (RyR2) связаны с различными сердечными аритмиями, такими как катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (CPVT), идиопатическая фибрилляция желудочков и фибрилляция предсердий, а также структурные заболевания сердца, такие как , и кардиомиопатии без уплотнения [2–5].Чтобы понять различные механизмы заболевания, связанные с мутациями RyR2, и разработать основанные на механизмах стратегии диагностики и лечения заболеваний, связанных с RyR2, необходимо понимать точные молекулярные дефекты отдельных мутаций RyR2.

Учитывая их фундаментальное и клиническое значение, за последнее десятилетие был проведен ряд структурных и функциональных исследований для изучения влияния связанных с заболеванием мутаций RyR2. Эти исследования позволили получить важную информацию о действиях мутаций болезней.Однако изучена лишь небольшая часть известных мутаций RyR2. Функциональные последствия некоторых изученных мутаций RyR2 неясны и спорны. Например, Meli et al. [38] показали, что мутация RyR2-G230C не влияет на активацию Ca ²⁺ одиночных каналов RyR2, включенных в плоские липидные бислои в условиях покоя. Напротив, мы обнаружили, что отдельные каналы RyR2-G230C демонстрируют заметно повышенную чувствительность к активации Ca ²⁺ [21].Кроме того, мы показали, что мутация G230C увеличивала зависимую от Ca ²⁺ активацию связывания [ ³ H] рианодина, усиливала склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ , снижала порог активации высвобождения Ca ²⁺ . и прекращение, и уменьшило термостабильность N-концевой области RyR2 [21]. Этот остаток G230 является частью консервативного мотива Gly-Gly, который образует виток на границе раздела между доменами A и B. Замена G230 на цистеин (G230C), вероятно, повлияет на геометрию витка и, следовательно, на относительную ориентацию / упаковку. областей A и B.В соответствии с этой точкой зрения, наши данные показывают, что мутация G230C действительно оказывает драматическое влияние на функцию и структуру RyR2 [21].

В отличие от мутации G230C Cheung et al. [23] показали, что мутация h39D значительно усиливает активацию одиночных каналов RyR2 диастолическим цитозольным Ca ²⁺ . Было высказано предположение, что повышенная активность мутантного канала h39D в диастолическом цитозольном Ca ²⁺ приведет к «дырявому» каналу в условиях покоя, что может объяснить желудочковую тахиаритмию, возникающую у мутантных носителей RyR2-h39D в состоянии покоя [23] .Остаток h39 расположен в петле между бета-листами 1 и 2 в N-концевом домене A. Эта петля лежит на поверхности трехмерной структуры RyR [8,12–16]. Следовательно, в отличие от многих других связанных с заболеванием мутаций RyR2 в N-концевой области, остаток h39 не расположен на границе раздела домен-домен, ни в N-концевой области, ни в других соседних доменах, недавно идентифицированных в недавних исследованиях крио-ЭМ. RyR [16]. Он также не участвует в координации центрального хлорид-иона [12], не расположен на известном интерфейсе с вспомогательными белками RyR2 [17] и не скрыт внутри домена, где он может мешать сворачиванию.Напротив, было обнаружено, что боковая цепь h39 очень гибкая во множественных кристаллических структурах [12], подразумевая, что она даже не взаимодействует с боковыми цепями соседних остатков. Учитывая эти наблюдения, возникает недоумение, как мутация h39D может изменить внутренние свойства канала RyR2. Чтобы ответить на этот важный вопрос, мы провели ряд функциональных анализов, чтобы определить влияние мутации h39D. В отличие от описанных Cheung et al., Мы обнаружили, что мутация h39D не изменяет активацию одиночных каналов RyR2 цитозольным Ca ²⁺ .Более того, мы показали, что мутация h39D не влияет на зависимую от Ca ²⁺ активацию связывания [ ³ H] рианодина, склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ , порог высвобождения Ca ²⁺ . активация или завершение, или термостабильность N-концевой области RyR2. Таким образом, наши данные о влиянии мутаций G230C [21] и h39D на отдельные каналы RyR2 отличаются от данных Meli et al. [38] и Cheung et al. [23]. Точные причины этих противоречий в настоящее время неизвестны.Вероятно, будут задействованы различия в экспериментальных условиях, таких как условия для трансфекции, источники / статус каналов RyR2, используемых для одноканальных исследований, и условия для одноканальной записи. Например, мы использовали 250 мМ K ⁺ в качестве носителя заряда для наших одноканальных записей, тогда как Cheung et al. [23] использовали 53 мМ Ca ²⁺ в качестве носителя заряда. Кроме того, мы охарактеризовали влияние мутации h39D на функцию RyR2 мыши, тогда как Cheung et al.[23] изучали RyR2 человека. Возможно, что структура N-концевых доменов в интактном RyR2 человека немного отличается от таковой в RyR2 интактной мыши, так что мутация h39D может влиять на функцию RyR2 человека, но не RyR2 мыши. Очевидно, что для разрешения этих разногласий потребуется дополнительная работа. Тем не менее, наши данные, полученные в результате одноканального анализа, анализа связывания [ ³ H] рианодина и высвобождения Ca ²⁺ , визуализации отдельных клеток Ca ²⁺ и структурного анализа четко демонстрируют, что мутация h39D оказывает незначительное влияние или не оказывает никакого влияния. от внутренней функции RyR2 мыши или структурной стабильности N-концевой области.

Однако неясно, как мутация h39D, которая не изменяет внутреннюю функцию канала RyR2, вызывает желудочковую тахиаритмию в покое. Хотя мутация h39D не влияет на изолированный канал RyR2, она может изменять взаимодействия между RyR2 и его регуляторными белками в сердечных клетках. Остаток h39 экспонируется на поверхности в верхней части цитозольного узла структуры RyR2. В настоящее время не показано, что вспомогательный белок взаимодействует напрямую с N-концевой областью RyR, но остается возможность, что такой партнер по связыванию существует.Эта часть структуры RyR2 может взаимодействовать с белками, связанными с поперечной трубчатой ​​мембраной. Таким образом, возможно, что мутация RyR2-h39D может изменять сцепление возбуждения-сокращения или высвобождение SR Ca ²⁺ , влияя на белок-белковые взаимодействия, которые регулируют функцию RyR2. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, изменяет ли мутация RyR2-h39D функцию RyR2 и высвобождение SR Ca ²⁺ в контексте сердечных клеток, интактного сердца или животных моделей.

Хотя мутация h39D не влияет на цитозольную активацию RyR2 Ca ²⁺ , еще предстоит определить, влияет ли мутация h39D на активацию RyR2 в просвете Ca ²⁺ . Ранее мы показали, что ряд мутаций RyR2 CPVT усиливает активацию канала просветом Ca ²⁺ и склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ при перегрузке хранилища Ca ²⁺ (SOICR) [18,20 , 26,31]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что мутация h39D не влияет на склонность к SOICR или порог активации или прекращения SOICR.Учитывая тесную связь между SOICR и активацией Ca ²⁺ в просвете, отсутствие эффекта h39D на SOICR предполагает, что мутация h39D вряд ли окажет большое влияние на активацию Ca ²⁺ в просвете. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы напрямую оценить влияние h39D на активацию RyR2 Ca ²⁺ в просвете.

Таким образом, в настоящем исследовании мы охарактеризовали влияние недавно идентифицированной мутации RyR2 h39D, которая, как считается, связана с желудочковой аритмией в покое, с использованием ряда биохимических, электрофизиологических методов визуализации и визуализации Ca ²⁺ .Наши данные показывают, что, в отличие от предыдущего исследования [23], мутация RyR2-h39D не влияет на цитозольную активацию Ca ²⁺ RyR2. Наши результаты также демонстрируют, что мутация h39D не изменяет склонность к спонтанному высвобождению Ca ²⁺ , хорошо известной причины запускаемой аритмии.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Канадских институтов исследований в области здравоохранения, Фонда сердца и инсульта Альберты, Канадского фонда инноваций и Фонда сердца и инсульта / Института сердечно-сосудистой системы им. Либина Профессор в области сердечно-сосудистых исследований С.R.W.C., научный сотрудник Alberta Innovates-Health Solutions (AIHS). FVP поддерживается CIHR (125893).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ZX WG SMWKY RW FVP SRWC. Провел эксперименты: ZX WG SMWKY RW LZ. Проанализированы данные: ZX WG SMWKY LZ FVP SRWC. Написал статью: ZX WG SMWKY RW FVP SRWC.

Ссылки

1. 1. Берс ДМ. Связь возбуждения и сокращения сердца. Природа. 2002; 415: 198–205. pmid: 11805843
2. 2.Берс ДМ. Утечка кальция из саркоплазматического ретикулума сердца: основы и роль в сердечной дисфункции. Annu Rev Physiol. 2014; 76: 107–127. pmid: 24245942
3. 3. Джордж СН, Джунди Х, Томас Н.Л., Фрай Д.Л., Лай Ф.А. Рецепторы рианодина и желудочковые аритмии: новые тенденции в мутациях, механизмах и методах лечения. J Mol Cell Cardiol. 2007; 42: 34–50. pmid: 17081562
4. 4. Мохамед У, Наполитано С., Приори С.Г. Молекулярные и электрофизиологические основы катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии.J Cardiovasc Electrophysiol. 2007. 18: 791–797. pmid: 17578347
5. 5. Приори С.Г., Чен С.Р. Унаследованная дисфункция обработки Са2 + саркоплазматического ретикулума и аритмогенез. Circ Res. 2011; 108: 871–883. pmid: 21454795
6. 6. Амадор Ф.Дж., Лю С., Исияма Н., Плевин М.Дж., Уилсон А., МакЛеннан Д.Х. и др. Кристаллическая структура амино-концевого домена бета-трилистника рианодинового рецептора I типа выявляет петлю «горячей точки», связанную с мутациями. Proc Natl Acad Sci U S A.2009; 106: 11040–11044. pmid: 19541610
7. 7. Лобо П.А., Ван Петегем Ф. Кристаллические структуры N-концевых доменов рианодиновых рецепторов сердечных и скелетных мышц: понимание мутаций болезней. Состав. 2009. 17: 1505–1514. pmid: 195
8. 8. Тунг СС, Лобо П.А., Кимлика Л., Ван Петегем Ф. Горячая точка амино-терминального заболевания рианодиновых рецепторов образует цитоплазматический вестибюль. Природа. 2010; 468: 585–588. pmid: 21048710
9. 9. Лобо PA, Kimlicka L, Tung CC, Van Petegem F.Удаление экзона 3 в сердечном рианодиновом рецепторе устраняется переключением бета-цепи. Состав. 2011; 19: 790–798. pmid: 21645850
10. 10. Ван Петегем Ф. Рецепторы рианодина: структура и функции. J Biol Chem. 2012; 287: 31624–31632. pmid: 22822064
11. 11. Амадор Ф.Дж., Кимлика Л., Статопулос П.Б., Гасми-Сибрук Г.М., Макленнан Д.Х., Ван Петегем Ф. и др. Домен А рецептора рианодина 2 типа содержит уникальную и динамическую альфа-спираль, которая переходит в бета-цепь у мутанта, связанного с наследственной кардиомиопатией.J Mol Biol. 2013. pmid: 23978697
12. 12. Kimlicka L, Tung CC, Carlsson AC, Lobo PA, Yuchi Z, Van Petegem F. N-концевая область сердечного рианодинового рецептора содержит сайт связывания аниона, на который нацелены мутации при болезни. Состав. 2013; 21: 1440–1449. pmid: 23871484
13. 13. Kimlicka L, Lau K, Tung CC, Van Petegem F. Болезненные мутации в N-концевой области рианодинового рецептора соединяются с мобильным межсубъединичным интерфейсом. Nat Commun. 2013; 4: 1506. pmid: 23422674
14. 14.Ефремов Р.Г., Лейтнер А., Эберсолд Р., Раунсер С. Архитектура и механизм конформационного переключения рианодинового рецептора. Природа. 2015; 517: 39–43. pmid: 25470059
15. 15. Залк Р., Кларк О. Б., де Жорж А., Грассуччи Р. А., Рейкен С., Мансия Ф. и др. Структура рианодинового рецептора млекопитающих. Природа. 2015; 517: 44–49. pmid: 25470061
16. 16. Янь З., Бай XC, Янь Ц., Ву Дж, Ли З, Се Т. и др. Структура кроличьего рианодинового рецептора RyR1 при разрешении, близком к атомному.Природа. 2015; 517: 50–55. pmid: 25517095
17. 17. Ван Петегем Ф. Рецепторы рианодина: гиганты аллостерических ионных каналов. J Mol Biol. 2015; 427: 31–53. pmid: 25134758
18. 18. Jiang D, Wang R, Xiao B, Kong H, Hunt DJ, Choi P и др. Повышенное высвобождение Ca2 +, вызванное перегрузкой магазина, и чувствительность каналов к люминальной активации Ca2 + являются частыми дефектами мутаций RyR2, связанными с желудочковой тахикардией и внезапной смертью. Circ Res. 2005; 97: 1173–1181. pmid: 16239587
19. 19.Цзян Д., Джонс П.П., Дэвис Д.Р., Гоу Р., Грин М.С., Бирни Д.Х. и др. Характеристика новой мутации сердечного рианодинового рецептора, которая приводит к катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардии. Каналы (Остин). 2010; 4: 302–310.
20. 20. Тан И, Тиан Х, Ван Р, Филл М, Чен СР. Аномальное прекращение высвобождения Ca2 + является частым дефектом мутаций RyR2, связанных с кардиомиопатиями. Circ Res. 2012; 110: 968–977. pmid: 22374134
21. 21. Лю Ю., Кимлика Л., Хисс Ф., Тиан Х, Ван Р., Чжан Л. и др.Мутация G230C RyR2, связанная с CPVT, усиливает вызванное перегрузкой хранилища высвобождение Ca2 + и дестабилизирует N-концевые домены. Биохим Дж. 2013; 454: 123–131. pmid: 23746327
22. 22. Лю Ю., Сунь Б., Сяо З., Ван Р., Го В., Чжан Дж. З. и др. Роль Nh3-концевых доменов сердечного рианодинового рецептора в активации и прекращении высвобождения Са2 +. J Biol Chem. 2015; 290: 7736–7746. pmid: 25627681
23. 23. Cheung JW, Meli AC, Xie W., Mittal S, Reiken S, Wronska A и др.Короткосвязанная полиморфная желудочковая тахикардия в состоянии покоя, связанная с мутацией нового рианодинового рецептора (RyR2): протекающие каналы RyR2 в нестрессовых условиях. Int J Cardiol. 2015; 180: 228–236. pmid: 25463374
24. 24. Хо С. Н., Хант HD, Хортон Р. М., Пуллен Дж. К., Пиз Л. Р.. Сайт-направленный мутагенез путем перекрывающегося удлинения с использованием полимеразной цепной реакции [см. Комментарии]. Ген. 1989; 77: 51–59. pmid: 2744487
25. 25. Чжао М., Ли П, Ли Х, Чжан Л., Винкфейн Р.Дж., Чен С.Р.Молекулярная идентификация порообразующего сегмента рианодинового рецептора. J Biol Chem. 1999; 274: 25971–25974. pmid: 10473538
26. 26. Чен В., Ван Р., Чен Б., Чжун Х, Конг Х, Бай И и др. Ворота, определяющие запасы рианодинового рецептора, контролируют волны Ca (2+) и аритмии, вызванные Ca (2+). Nat Med. 2014; 20: 184–192. pmid: 24441828
27. 27. Ли П., Чен С.Р. Молекулярная основа ca (2) + активация сердечного ca (2) мыши + канал высвобождения (рецептор рианодина). J Gen Physiol.2001; 118: 33–44. pmid: 11429443
28. 28. Фабиато А., Фабиато Ф. Калькуляционные программы для расчета состава растворов, содержащих несколько металлов и лигандов, используемых для экспериментов с кожными мышечными клетками. J Physiol (Париж). 1979; 75: 463–505.
29. 29. Laemmli UK. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа. 1970; 227: 680–65. pmid: 5432063
30. 30. Таубин Х., Стэхелин Т, Гордон Дж.Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1979; 76: 4350–434. pmid: 388439
31. 31. Цзян Д., Сяо Б., Ян Д., Ван Р., Чой П., Чжан Л. и др. Мутации RyR2, связанные с желудочковой тахикардией и внезапной смертью, снижают порог выброса Ca2 +, вызванного перегрузкой магазинов (SOICR). 2004. 101: 13062–13067. pmid: 15322274
32. 32. Палмер А.Е., Джин С., Рид Дж.С., Цзянь Р.Ю.Bcl-2-опосредованные изменения в Ca2 + эндоплазматического ретикулума анализируются с помощью улучшенного генетически кодируемого флуоресцентного сенсора. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 17404–17409. pmid: 15585581
33. 33. Джонс П.П., Цзян Д., Болстад Дж., Хант Д.Д., Чжан Л., Деморекс Н. и др. Измерения Ca2 + в эндоплазматическом ретикулуме показывают, что мутации сердечного рианодинового рецептора, связанные с сердечной аритмией и внезапной смертью, изменяют порог выброса Ca2 +, вызванного перегрузкой магазинов. Биохим Дж. 2008; 412: 171–178.pmid: 18092949
34. 34. Тиан Х, Лю И, Лю И, Ван Р., Вагенкнехт Т., Лю З. и др. Лиганд-зависимые конформационные изменения в области зажима сердечного рианодинового рецептора. J Biol Chem. 2013; 288: 4066–4075. pmid: 23258540
35. 35. Неттлшип Дж., Браун Дж., Гровс М.Р., Герлоф А. Методы определения характеристик белков с помощью масс-спектрометрии, анализа теплового сдвига (ThermoFluor) и многоуглового или статического светорассеяния. Методы Мол биол. 2008; 426: 299–318. pmid: 18542872
36. 36.Конг Х., Джонс П.П., Куп А., Чжан Л., Дафф Х.Дж., Чен С.Р. Кофеин вызывает высвобождение Ca2 + за счет снижения порога активации Ca2 + в просвете рианодинового рецептора. Биохим Дж. 2008; 414: 441–452. pmid: 18518861
37. 37. Лау К., Ван Петегем Ф. Кристаллические структуры дикого типа и мутантных форм домена рианодинового рецептора SPRY2. Nat Commun. 2014; 5: 5397. pmid: 25370123
38. 38. Meli AC, Refaat MM, Dura M, Reiken S, Wronska A, Wojciak J, et al.Новая мутация рецептора рианодина, связанная с внезапной смертью, увеличивает чувствительность к цитозольному кальцию. Circ Res. 2011; 109: 281–290. pmid: 21659649

.